વ્યાપક પ્રોટીઓમિક્સ એસિમ્પટમેટિક અને સિમ્પ્ટોમેટિક અલ્ઝાઇમર રોગમાં મગજ આધારિત સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી બાયોમાર્કર્સને જાહેર કરે છે

અલ્ઝાઈમર રોગ (AD) માં પ્રોટીન બાયોમાર્કર્સનો અભાવ છે જે તેના બહુવિધ અંતર્ગત પેથોફિઝિયોલોજીને પ્રતિબિંબિત કરે છે, જે નિદાન અને સારવારની પ્રગતિને અવરોધે છે. અહીં, અમે સેરેબ્રોસ્પાઇનલ ફ્લુઇડ (CSF) બાયોમાર્કર્સને ઓળખવા માટે વ્યાપક પ્રોટીઓમિક્સનો ઉપયોગ કરીએ છીએ જે એડી પેથોફિઝિયોલોજીની વ્યાપક શ્રેણીનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે. મલ્ટિપ્લેક્સ માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રીએ AD CSF અને મગજમાં અનુક્રમે 3,500 અને આશરે 12,000 પ્રોટીનની ઓળખ કરી. મગજના પ્રોટીઓમના નેટવર્ક વિશ્લેષણથી 44 જૈવવિવિધતા મોડ્યુલો ઉકેલાયા, જેમાંથી 15 સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી પ્રોટીઓમ સાથે ઓવરલેપ થયા. આ ઓવરલેપિંગ મોડ્યુલોમાં CSF AD માર્કર્સને પાંચ પ્રોટીન જૂથોમાં ફોલ્ડ કરવામાં આવે છે, જે વિવિધ પેથોફિઝીયોલોજીકલ પ્રક્રિયાઓનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે. AD મગજમાં ચેતોપાગમ અને ચયાપચય ઘટે છે, પરંતુ CSF વધે છે, જ્યારે મગજ અને CSFમાં ગ્લિયાલ-સમૃદ્ધ માઇલિનેશન અને રોગપ્રતિકારક જૂથો વધે છે. પેનલ ફેરફારોની સુસંગતતા અને રોગની વિશિષ્ટતા 500 થી વધુ વધારાના CSF નમૂનાઓમાં પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી. આ જૂથોએ એસિમ્પટમેટિક AD માં જૈવિક પેટાજૂથોને પણ ઓળખ્યા. એકંદરે, આ પરિણામો AD માં ક્લિનિકલ એપ્લિકેશન્સ માટે વેબ-આધારિત બાયોમાર્કર ટૂલ્સ તરફ એક આશાસ્પદ પગલું છે.
અલ્ઝાઈમર રોગ (એડી) એ વિશ્વભરમાં ન્યુરોડિજનરેટિવ ડિમેન્શિયાનું સૌથી સામાન્ય કારણ છે અને તે જૈવિક પ્રણાલીની તકલીફોની વિશાળ શ્રેણી દ્વારા વર્ગીકૃત થયેલ છે, જેમાં સિનેપ્ટિક ટ્રાન્સમિશન, ગ્લિયાલ-મધ્યસ્થ પ્રતિરક્ષા અને મિટોકોન્ડ્રીયલ મેટાબોલિઝમ (1-3) નો સમાવેશ થાય છે. જો કે, તેના સ્થાપિત પ્રોટીન બાયોમાર્કર્સ હજુ પણ એમીલોઇડ અને ટાઉ પ્રોટીન શોધવા પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કરે છે, અને તેથી આ વિવિધ પેથોફિઝિયોલોજીને પ્રતિબિંબિત કરી શકતા નથી. આ "કોર" પ્રોટીન બાયોમાર્કર્સ કે જે સેરેબ્રોસ્પાઇનલ ફ્લુઇડ (CSF) માં સૌથી વધુ વિશ્વસનીય રીતે માપવામાં આવે છે તેમાં (i) એમાયલોઇડ બીટા પેપ્ટાઇડ 1-42 (Aβ1-42) નો સમાવેશ થાય છે, જે કોર્ટિકલ એમીલોઇડ પ્લેક્સની રચનાને પ્રતિબિંબિત કરે છે; (ii) કુલ ટાઉ, ચેતાક્ષના અધોગતિની નિશાની; (iii) ફોસ્ફો-ટાઉ (પી-ટાઉ), પેથોલોજીકલ ટાઉ હાઇપરફોસ્ફોરીલેશન (4-7) નો પ્રતિનિધિ. જો કે આ સેરેબ્રોસ્પાઇનલ ફ્લુઇડ બાયોમાર્કર્સે "ચિહ્નિત" AD પ્રોટીન રોગો (4-7) ની શોધમાં અમને મોટા પ્રમાણમાં સુવિધા આપી છે, તેમ છતાં, તેઓ રોગ પાછળના જટિલ જીવવિજ્ઞાનના માત્ર એક નાના ભાગને રજૂ કરે છે.
AD બાયોમાર્કર્સની પેથોફિઝિયોલોજિકલ વિવિધતાના અભાવે ઘણા પડકારો તરફ દોરી જાય છે, જેમાં (i) એડી દર્દીઓની જૈવિક વિજાતીયતાને ઓળખવામાં અને તેનું પ્રમાણ નક્કી કરવામાં અસમર્થતા, (ii) રોગની તીવ્રતા અને પ્રગતિનું અપર્યાપ્ત માપ, ખાસ કરીને પૂર્વનિર્ધારણ તબક્કામાં, અને ( iii) રોગનિવારક દવાઓનો વિકાસ જે ન્યુરોલોજીકલ બગાડના તમામ પાસાઓને સંપૂર્ણપણે ઉકેલવામાં નિષ્ફળ ગયો. સંબંધિત રોગોમાંથી એડીનું વર્ણન કરવા માટે સીમાચિહ્નરૂપ પેથોલોજી પરની અમારી નિર્ભરતા આ સમસ્યાઓને વધારે છે. વધુ અને વધુ પુરાવાઓ દર્શાવે છે કે ઉન્માદ ધરાવતા મોટા ભાગના વૃદ્ધ લોકો જ્ઞાનાત્મક ઘટાડા (8) ની એક કરતાં વધુ પેથોલોજીકલ લાક્ષણિકતાઓ ધરાવે છે. AD પેથોલોજી ધરાવતી 90% કે તેથી વધુ વ્યક્તિઓને પણ વેસ્ક્યુલર ડિસીઝ, TDP-43 ઇન્ક્લુઝન અથવા અન્ય ડીજનરેટિવ રોગો (9) હોય છે. પેથોલોજીકલ ઓવરલેપના આ ઉચ્ચ પ્રમાણોએ ડિમેન્શિયા માટેના અમારા વર્તમાન ડાયગ્નોસ્ટિક માળખાને વિક્ષેપિત કર્યો છે, અને રોગની વધુ વ્યાપક પેથોફિઝીયોલોજીકલ વ્યાખ્યાની જરૂર છે.
વિવિધ એડી બાયોમાર્કર્સની તાત્કાલિક જરૂરિયાતને ધ્યાનમાં રાખીને, ક્ષેત્ર વધુને વધુ બાયોમાર્કર્સ શોધવા માટે એકંદર સિસ્ટમ પર આધારિત "ઓમિક્સ" પદ્ધતિ અપનાવી રહ્યું છે. એક્સિલરેટેડ ફાર્માસ્યુટિકલ પાર્ટનરશિપ (AMP)-AD એલાયન્સ 2014 માં શરૂ કરવામાં આવ્યું હતું અને તે પ્રોગ્રામમાં મોખરે છે. નેશનલ ઇન્સ્ટિટ્યૂટ ઑફ હેલ્થ, એકેડેમિયા અને ઉદ્યોગ દ્વારા આ બહુ-શાખાકીય પ્રયાસનો હેતુ AD ના પેથોફિઝિયોલોજીને વધુ સારી રીતે વ્યાખ્યાયિત કરવા અને જૈવવિવિધતા નિદાન વિશ્લેષણ અને સારવાર વ્યૂહરચનાઓ વિકસાવવા માટે સિસ્ટમ-આધારિત વ્યૂહરચનાઓનો ઉપયોગ કરવાનો છે (10). આ પ્રોજેક્ટના ભાગ રૂપે, નેટવર્ક પ્રોટીઓમિક્સ એ AD માં સિસ્ટમ-આધારિત બાયોમાર્કર્સની પ્રગતિ માટે એક આશાસ્પદ સાધન બની ગયું છે. આ નિષ્પક્ષ ડેટા-સંચાલિત અભિગમ જટિલ પ્રોટીઓમિક્સ ડેટા સમૂહોને જૂથો અથવા સહ-વ્યક્ત પ્રોટીનના "મોડ્યુલ્સ" માં ગોઠવે છે જે ચોક્કસ કોષના પ્રકારો, ઓર્ગેનેલ્સ અને જૈવિક કાર્યો (11-13) સાથે સંકળાયેલા છે. એડી મગજ (13-23) પર લગભગ 12 માહિતી-સમૃદ્ધ નેટવર્ક પ્રોટીઓમિક્સ અભ્યાસ હાથ ધરવામાં આવ્યા છે. એકંદરે, આ વિશ્લેષણો સૂચવે છે કે AD મગજ નેટવર્ક પ્રોટીઓમ સ્વતંત્ર સમૂહો અને બહુવિધ કોર્ટિકલ પ્રદેશોમાં અત્યંત સંરક્ષિત મોડ્યુલર સંસ્થા જાળવી રાખે છે. વધુમાં, આમાંના કેટલાક મોડ્યુલો સમગ્ર ડેટા સેટમાં AD-સંબંધિત વિપુલતામાં પુનઃઉત્પાદનક્ષમ ફેરફારો દર્શાવે છે, જે બહુવિધ રોગોના પેથોફિઝિયોલોજીને પ્રતિબિંબિત કરે છે. સામૂહિક રીતે, આ તારણો AD માં સિસ્ટમ-આધારિત બાયોમાર્કર તરીકે મગજ નેટવર્ક પ્રોટીઓમની શોધ માટે એક આશાસ્પદ એન્કર પોઇન્ટ દર્શાવે છે.
AD મગજ નેટવર્ક પ્રોટીઓમને તબીબી રીતે ઉપયોગી સિસ્ટમ-આધારિત બાયોમાર્કર્સમાં રૂપાંતરિત કરવા માટે, અમે AD CSF ના પ્રોટીઓમિક વિશ્લેષણ સાથે મગજમાંથી મેળવેલા નેટવર્કને જોડી દીધું છે. આ સંકલિત અભિગમને કારણે CSF બાયોમાર્કર્સના પાંચ આશાસ્પદ સેટની ઓળખ થઈ કે જે મગજ આધારિત પેથોફિઝિયોલોજીની વિશાળ શ્રેણી સાથે સંકળાયેલા છે, જેમાં ચેતોપાગમ, રક્તવાહિનીઓ, માયલિનેશન, બળતરા અને મેટાબોલિક પાથવેઝની તકલીફનો સમાવેશ થાય છે. અમે વિવિધ ન્યુરોડિજનરેટિવ રોગોના 500 થી વધુ CSF નમૂનાઓ સહિત બહુવિધ પ્રતિકૃતિ વિશ્લેષણ દ્વારા આ બાયોમાર્કર પેનલ્સને સફળતાપૂર્વક માન્ય કર્યું છે. આ માન્યતા વિશ્લેષણોમાં એસિમ્પ્ટોમેટિક એડી (એસીએમએડી) ધરાવતા દર્દીઓના CSF માં જૂથ લક્ષ્યોની તપાસ અથવા સામાન્ય જ્ઞાનાત્મક વાતાવરણમાં અસામાન્ય એમીલોઇડ સંચયના પુરાવા દર્શાવવાનો સમાવેશ થાય છે. આ વિશ્લેષણો AsymAD વસ્તીમાં નોંધપાત્ર જૈવિક વિજાતીયતાને પ્રકાશિત કરે છે અને પેનલ માર્કર્સને ઓળખે છે જે રોગના પ્રારંભિક તબક્કામાં વ્યક્તિઓને પેટાપ્રકાર કરી શકે છે. એકંદરે, આ પરિણામો બહુવિધ સિસ્ટમો પર આધારિત પ્રોટીન બાયોમાર્કર ટૂલ્સના વિકાસમાં એક મુખ્ય પગલું રજૂ કરે છે જે એડી દ્વારા સામનો કરવામાં આવતા ઘણા ક્લિનિકલ પડકારોને સફળતાપૂર્વક હલ કરી શકે છે.
આ અભ્યાસનો મુખ્ય હેતુ નવા સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી બાયોમાર્કર્સને ઓળખવાનો છે જે મગજ આધારિત વિવિધ પેથોફિઝિયોલોજીને પ્રતિબિંબિત કરે છે જે AD તરફ દોરી જાય છે. આકૃતિ S1 અમારી સંશોધન પદ્ધતિની રૂપરેખા આપે છે, જેમાં (i) મગજ સંબંધિત CSF રોગના બાયોમાર્કર્સને ઓળખવા માટે AD CSF અને નેટવર્ક બ્રેઇન પ્રોટીઓમના પ્રારંભિક તારણો દ્વારા સંચાલિત વ્યાપક વિશ્લેષણ અને (ii) અનુગામી પ્રતિકૃતિ આ બાયોમાર્કર્સ અનેક સ્વતંત્ર સેરેબ્રોસ્પાઇનલમાં છે. પ્રવાહી સમૂહ. ઇમોરી ગોઇઝ્યુએટા અલ્ઝાઇમર ડિસીઝ રિસર્ચ સેન્ટર (ADRC) ખાતે 20 જ્ઞાનાત્મક રીતે સામાન્ય વ્યક્તિઓ અને 20 AD દર્દીઓમાં CSF ના વિભેદક અભિવ્યક્તિના વિશ્લેષણ સાથે શોધ-લક્ષી સંશોધન શરૂ થયું. AD ના નિદાનને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીમાં નીચા Aβ1-42 અને કુલ ટાઉ અને પી-ટાઉના એલિવેટેડ સ્તરોની હાજરીમાં નોંધપાત્ર જ્ઞાનાત્મક ક્ષતિ તરીકે વ્યાખ્યાયિત કરવામાં આવે છે [મીન મોન્ટ્રીયલ કોગ્નિટિવ એસેસમેન્ટ (MoCA), 13.8 ± 7.0] [ELISA (ELISA) )]] (કોષ્ટક S1A). નિયંત્રણ (એટલે ​​કે MoCA, 26.7 ± 2.2)માં CSF બાયોમાર્કર્સનું સામાન્ય સ્તર હતું.
માનવ CSF પ્રોટીનની વિપુલતાની ગતિશીલ શ્રેણી દ્વારા વર્ગીકૃત થયેલ છે, જેમાં આલ્બ્યુમિન અને અન્ય અત્યંત વિપુલ પ્રમાણમાં પ્રોટીન રસના પ્રોટીનની શોધને અટકાવી શકે છે (24). પ્રોટીન શોધની ઊંડાઈ વધારવા માટે, અમે માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (MS) વિશ્લેષણ (24) પહેલાં દરેક CSF નમૂનામાંથી પ્રથમ 14 અત્યંત વિપુલ પ્રમાણમાં પ્રોટીન દૂર કર્યા. એમએસ દ્વારા કુલ 39,805 પેપ્ટાઇડ્સ ઓળખવામાં આવ્યા હતા, જે 40 નમૂનાઓમાં 3691 પ્રોટીઓમ સાથે મેપ કરવામાં આવ્યા હતા. પ્રોટીનનું પ્રમાણીકરણ બહુવિધ ટેન્ડમ માસ ટેગ (TMT) લેબલીંગ (18, 25) દ્વારા કરવામાં આવે છે. ગુમ થયેલ ડેટાને ઉકેલવા માટે, અમે ફક્ત તે જ પ્રોટીનનો સમાવેશ કર્યો છે જે અનુગામી વિશ્લેષણમાં ઓછામાં ઓછા 50% નમૂનાઓમાં પરિમાણિત કરવામાં આવ્યા હતા, આમ આખરે 2875 પ્રોટીઓમનું પ્રમાણ નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું. કુલ પ્રોટીન વિપુલતા સ્તરોમાં નોંધપાત્ર તફાવતને કારણે, નિયંત્રણ નમૂનાને આંકડાકીય રીતે આઉટલીયર (13) ગણવામાં આવતું હતું અને પછીના વિશ્લેષણમાં તેનો સમાવેશ કરવામાં આવ્યો ન હતો. બાકીના 39 નમૂનાઓના વિપુલતા મૂલ્યો વય, લિંગ અને બેચ સહવર્તી (13-15, 17, 18, 20, 26) અનુસાર ગોઠવવામાં આવ્યા હતા.
રીગ્રેસન ડેટા સેટ પર વિભેદક અભિવ્યક્તિનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે આંકડાકીય ટી-ટેસ્ટ વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરીને, આ પૃથ્થકરણે એવા પ્રોટીનને ઓળખ્યા કે જેના વિપુલતા સ્તરો નિયંત્રણ અને AD કેસો (કોષ્ટક S2A) વચ્ચે નોંધપાત્ર રીતે બદલાયા હતા (P <0.05). આકૃતિ 1A માં બતાવ્યા પ્રમાણે, AD માં કુલ 225 પ્રોટીનની વિપુલતામાં નોંધપાત્ર ઘટાડો થયો હતો, અને 303 પ્રોટીનની વિપુલતામાં નોંધપાત્ર વધારો થયો હતો. આ વિભિન્ન રીતે વ્યક્ત કરાયેલા પ્રોટીનમાં અગાઉ ઓળખાયેલા કેટલાક સેરેબ્રોસ્પાઇનલ ફ્લુઇડ AD માર્કર્સનો સમાવેશ થાય છે, જેમ કે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ-સંબંધિત પ્રોટીન ટાઉ (MAPT; P = 3.52 × 10−8), ન્યુરોફિલામેન્ટ (NEFL; P = 6.56 × 10−3), વૃદ્ધિ-સંબંધિત પ્રોટીન 43 (GAP43; P = 1.46 × 10−5), ફેટી એસિડ બાઈન્ડિંગ પ્રોટીન 3 (FABP3; P = 2.00 × 10−5), Chitinase 3 જેમ 1 (CHI3L1; P = 4.44 × 10−6), ન્યુરલ ગ્રાન્યુલિન (NRGN; P = 3.43 × 10−4) અને VGF ચેતા વૃદ્ધિ પરિબળ (VGF; P = 4.83 × 10−3) (4-6). જો કે, અમે GDP ડિસોસિએશન ઇન્હિબિટર 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) અને SPARC-સંબંધિત મોડ્યુલર કેલ્શિયમ બાઈન્ડિંગ 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9) જેવા અન્ય ખૂબ જ મહત્વપૂર્ણ લક્ષ્યોને પણ ઓળખ્યા. 225 નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડેલા પ્રોટીનના જનીન ઓન્ટોલોજી (GO) વિશ્લેષણમાં સ્ટીરોઈડ ચયાપચય, રક્ત કોગ્યુલેશન અને હોર્મોન પ્રવૃત્તિ (આકૃતિ 1B અને કોષ્ટક S2B) જેવી શરીરની પ્રવાહી પ્રક્રિયાઓ સાથે ગાઢ જોડાણો બહાર આવ્યા છે. તેનાથી વિપરીત, 303 નું નોંધપાત્ર રીતે વધેલું પ્રોટીન કોષની રચના અને ઊર્જા ચયાપચય સાથે ગાઢ રીતે સંબંધિત છે.
(A) જ્વાળામુખી પ્લોટ ટી-ટેસ્ટ દ્વારા મેળવેલા -log10 આંકડાકીય P મૂલ્ય (y-axis) ની તુલનામાં લોગ2 ફોલ્ડ ફેરફાર (x-axis) દર્શાવે છે, જેનો ઉપયોગ નિયંત્રણ (CT) અને વચ્ચેના વિભેદક અભિવ્યક્તિને શોધવા માટે થાય છે. બધા પ્રોટીનમાંથી CSF પ્રોટીઓમના એડી કેસો. AD માં નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડેલા સ્તર (P <0.05) સાથેના પ્રોટીન વાદળી રંગમાં બતાવવામાં આવે છે, જ્યારે રોગમાં નોંધપાત્ર રીતે વધેલા સ્તરવાળા પ્રોટીન લાલ રંગમાં બતાવવામાં આવે છે. પસંદ કરેલ પ્રોટીન લેબલ થયેલ છે. (B) પ્રોટીન સંબંધિત ટોચની GO શરતો AD માં નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડો (વાદળી) અને વધારો (લાલ) છે. જૈવિક પ્રક્રિયાઓ, પરમાણુ કાર્યો અને સેલ્યુલર ઘટકોના ક્ષેત્રોમાં ઉચ્ચતમ z-સ્કોર સાથે ત્રણ GO શબ્દો બતાવે છે. (C) MS એ CSF નમૂના (ડાબે) માં MAPT સ્તર માપ્યું અને નમૂના ELISA tau સ્તર (જમણે) સાથે તેનો સહસંબંધ. સંબંધિત P મૂલ્ય સાથે પીયર્સન સહસંબંધ ગુણાંક પ્રદર્શિત થાય છે. એક AD કેસ માટે ELISA ડેટાના અભાવને કારણે, આ આંકડાઓમાં 39 વિશ્લેષણ કરાયેલા કેસોમાંથી 38 માટેના મૂલ્યોનો સમાવેશ થાય છે. (D) નિયંત્રણ પર દેખરેખ કરાયેલ ક્લસ્ટર વિશ્લેષણ (P <0.0001, બેન્જામિન-હોચબર્ગ (BH) એડજસ્ટેડ P <0.01) અને AD CSF એ ડેટા સેટમાં 65 સૌથી નોંધપાત્ર રીતે બદલાયેલ પ્રોટીનનો ઉપયોગ કરીને નમૂનાઓ શોધી કાઢ્યા. માનકીકરણ, સામાન્યીકરણ.
MAPT નું પ્રોટીઓમિક સ્તર સ્વતંત્ર રીતે માપેલા ELISA tau સ્તર (r = 0.78, P = 7.8 × 10-9; આકૃતિ 1C) સાથે નજીકથી સંબંધિત છે, જે અમારા MS માપનની માન્યતાને સમર્થન આપે છે. એમીલોઇડ પ્રિકર્સર પ્રોટીન (એપીપી) ના સ્તરે ટ્રિપ્સિન પાચન પછી, Aβ1-40 અને Aβ1-42 ના સી-ટર્મિનસ પર મેપ કરાયેલ આઇસોફોર્મ-વિશિષ્ટ પેપ્ટાઇડ્સને અસરકારક રીતે આયનાઇઝ કરી શકાતા નથી (27, 28). તેથી, અમે ઓળખેલ એપીપી પેપ્ટાઈડ્સને ELISA Aβ1-42 સ્તરો સાથે કોઈ લેવાદેવા નથી. દરેક કેસની વિભેદક અભિવ્યક્તિનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે, અમે નમૂનાઓ (કોષ્ટક S2A)નું નિરીક્ષણ કરેલ ક્લસ્ટર વિશ્લેષણ કરવા માટે P <0.0001 [ખોટા શોધ દર (FDR) સુધારેલ P <0.01] સાથે વિભિન્ન રીતે વ્યક્ત પ્રોટીનનો ઉપયોગ કર્યો. આકૃતિ 1D માં બતાવ્યા પ્રમાણે, આ 65 અત્યંત નોંધપાત્ર પ્રોટીન રોગની સ્થિતિ અનુસાર યોગ્ય રીતે ક્લસ્ટર નમૂનાઓ કરી શકે છે, સિવાય કે નિયંત્રણ જેવી લાક્ષણિકતાઓ ધરાવતા એક AD કેસ. આ 65 પ્રોટીનમાંથી, 63 એ.ડી.માં વધ્યા, જ્યારે માત્ર બે (CD74 અને ISLR)માં ઘટાડો થયો. કુલ મળીને, આ સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી વિશ્લેષણોએ AD માં સેંકડો પ્રોટીનની ઓળખ કરી છે જે રોગના બાયોમાર્કર્સ તરીકે કામ કરી શકે છે.
પછી અમે એડી મગજ પ્રોટીઓમનું સ્વતંત્ર નેટવર્ક વિશ્લેષણ કર્યું. આ શોધના મગજના સમૂહમાં નિયંત્રણ (n = 10), પાર્કિન્સન રોગ (PD; n = 10), મિશ્રિત AD/PD (n = 10) અને AD (n = 10) કેસોનો સમાવેશ થાય છે. ) નમૂના. Emery Goizueta ADRC. આ 40 કેસોની વસ્તી વિષયક અગાઉ વર્ણવેલ છે (25) અને કોષ્ટક S1B માં સારાંશ આપવામાં આવ્યા છે. અમે આ 40 મગજની પેશીઓ અને 27 કેસોની પ્રતિકૃતિ સમૂહનું વિશ્લેષણ કરવા TMT-MS નો ઉપયોગ કર્યો. કુલ મળીને, આ બે મગજ ડેટા સેટે 227,121 અનન્ય પેપ્ટાઇડ્સ ઉત્પન્ન કર્યા, જે 12,943 પ્રોટીઓમ (25) પર મેપ કરવામાં આવ્યા હતા. માત્ર તે પ્રોટીન કે જે ઓછામાં ઓછા 50% કેસોમાં પ્રમાણિત કરવામાં આવ્યા હતા તે પછીની તપાસમાં સમાવવામાં આવ્યા હતા. અંતિમ શોધ ડેટા સેટમાં 8817 જથ્થાબંધ પ્રોટીન હોય છે. ઉંમર, લિંગ અને પોસ્ટ-મોર્ટમ ઈન્ટરવલ (PMI) ના આધારે પ્રોટીન વિપુલતા સ્તરને સમાયોજિત કરો. રીગ્રેસન પછી સેટ કરેલ ડેટાના વિભેદક અભિવ્યક્તિ વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે >2000 પ્રોટીન સ્તરો નોંધપાત્ર રીતે બદલાયા હતા [P <0.05, વિભિન્નતાનું વિશ્લેષણ (ANOVA)] બે અથવા વધુ રોગ જૂથમાં. તે પછી, અમે વિભિન્ન રીતે વ્યક્ત કરાયેલ પ્રોટીન, અને AD/નિયંત્રણ અને/અથવા AD/PD સરખામણીઓ (આકૃતિ S2, A અને B, કોષ્ટક S2C) માં P <0.0001 પર આધારિત નિરીક્ષણ કરેલ ક્લસ્ટર વિશ્લેષણ કર્યું. આ 165 અત્યંત બદલાયેલ પ્રોટીન નિયંત્રણ અને PD નમૂનાઓમાંથી AD પેથોલોજી સાથેના કેસોને સ્પષ્ટપણે દર્શાવે છે, જે સમગ્ર પ્રોટીઓમમાં મજબૂત AD-વિશિષ્ટ ફેરફારોની પુષ્ટિ કરે છે.
અમે પછી શોધાયેલ મગજ પ્રોટીઓમ પર નેટવર્ક વિશ્લેષણ કરવા માટે વેઈટેડ જીન કો-એક્સપ્રેશન નેટવર્ક એનાલિસિસ (WGCNA) નામના અલ્ગોરિધમનો ઉપયોગ કર્યો, જે સમાન અભિવ્યક્તિ પેટર્ન (11-13) સાથે પ્રોટીન મોડ્યુલોમાં ડેટા સેટનું આયોજન કરે છે. વિશ્લેષણમાં સૌથી મોટા (M1, n = 1821 પ્રોટીન) થી સૌથી નાના (M44, n = 34 પ્રોટીન) (આકૃતિ 2A અને કોષ્ટક S2D) સુધીના 44 મોડ્યુલ (M) સહ-વ્યક્ત પ્રોટીનની ઓળખ કરવામાં આવી હતી. ઉપર જણાવ્યા મુજબ (13) દરેક મોડ્યુલના પ્રતિનિધિ અભિવ્યક્તિ પ્રોફાઇલ અથવા લાક્ષણિક પ્રોટીનની ગણતરી કરો, અને તેને રોગની સ્થિતિ અને એડી પેથોલોજી સાથે સંબંધ બનાવો, એટલે કે, અલ્ઝાઈમર ડિસીઝ રજિસ્ટ્રી (CERAD) અને બ્રાક સ્કોર (આકૃતિ 2B) નું જોડાણ સ્થાપિત કરો. એકંદરે, 17 મોડ્યુલો એડી ન્યુરોપેથોલોજી (પી <0.05) સાથે નોંધપાત્ર રીતે સંબંધિત હતા. આમાંના ઘણા રોગ-સંબંધિત મોડ્યુલો સેલ પ્રકાર-વિશિષ્ટ માર્કર (આકૃતિ 2B)થી સમૃદ્ધ છે. ઉપર જણાવ્યા મુજબ (13), સેલ પ્રકારનું સંવર્ધન મોડ્યુલ ઓવરલેપ અને કોષ પ્રકાર-વિશિષ્ટ જનીનોની સંદર્ભ સૂચિનું વિશ્લેષણ કરીને નક્કી કરવામાં આવે છે. આ જનીનો અલગ માઉસ ચેતાકોષો, એન્ડોથેલિયલ અને ગ્લિયલ કોશિકાઓમાં પ્રકાશિત ડેટામાંથી મેળવવામાં આવે છે. RNA સિક્વન્સિંગ (RNA-seq) પ્રયોગ (29).
(A) મગજના પ્રોટીઓમના WGCNA શોધો. (B) AD ન્યુરોપેથોલોજિકલ લાક્ષણિકતાઓ (ટોચ) સાથે, CERAD (Aβ પ્લેક) અને બ્રાક (ટાઉ ટેંગલ્સ) સ્કોર્સ સહિત મોડ્યુલર સિગ્નેચર પ્રોટીન (મોડ્યુલર પ્રોટીન અભિવ્યક્તિનો પ્રથમ મુખ્ય ઘટક) નું બાયવેટ મિડ કોરિલેશન (બાયકોર) વિશ્લેષણ. સકારાત્મક (લાલ) અને નકારાત્મક (વાદળી) સહસંબંધોની તીવ્રતા બે-રંગી ગરમીના નકશા દ્વારા બતાવવામાં આવે છે, અને ફૂદડી આંકડાકીય મહત્વ (P <0.05) દર્શાવે છે. દરેક પ્રોટીન મોડ્યુલના સેલ ટાઈપ એસોસિએશનનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે હાઈપરજીઓમેટ્રિક ફિશરની એક્ઝેક્ટ ટેસ્ટ (FET) (નીચે) નો ઉપયોગ કરો. લાલ શેડિંગની તીવ્રતા સેલ પ્રકાર સંવર્ધનની ડિગ્રી સૂચવે છે, અને ફૂદડી આંકડાકીય મહત્વ (P <0.05) સૂચવે છે. FET માંથી મેળવેલા P મૂલ્યને સુધારવા માટે BH પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરો. (C) મોડ્યુલર પ્રોટીનનું GO વિશ્લેષણ. દરેક મોડ્યુલ અથવા સંબંધિત મોડ્યુલ જૂથ માટે સૌથી નજીકથી સંબંધિત જૈવિક પ્રક્રિયાઓ બતાવવામાં આવે છે. ઓલિગો, ઓલિગોડેન્ડ્રોસાઇટ.
પાંચ નજીકથી સંબંધિત એસ્ટ્રોસાઇટ અને માઇક્રોગ્લિયા-સમૃદ્ધ મોડ્યુલોનો સમૂહ (M30, M29, M18, M24, અને M5) એ AD ન્યુરોપેથોલોજી (આકૃતિ 2B) સાથે મજબૂત સકારાત્મક સંબંધ દર્શાવે છે. ઓન્ટોલોજી વિશ્લેષણ આ ગ્લિયલ મોડ્યુલોને કોષની વૃદ્ધિ, પ્રસાર અને રોગપ્રતિકારક શક્તિ સાથે જોડે છે (આકૃતિ 2C અને કોષ્ટક S2E). બે વધારાના ગ્લિયલ મોડ્યુલો, M8 અને M22, પણ રોગમાં મજબૂત રીતે અપરેગ્યુલેટેડ છે. M8 એ ટોલ-જેવા રીસેપ્ટર પાથવે સાથે ખૂબ જ સંબંધિત છે, એક સિગ્નલિંગ કાસ્કેડ જે જન્મજાત રોગપ્રતિકારક પ્રતિભાવમાં મુખ્ય ભૂમિકા ભજવે છે (30). તે જ સમયે, M22 અનુવાદ પછીના ફેરફાર સાથે ગાઢ રીતે સંબંધિત છે. M2, જે ઓલિગોડેન્ડ્રોસાઇટ્સથી સમૃદ્ધ છે, તે એડી પેથોલોજી સાથે મજબૂત સકારાત્મક સંબંધ દર્શાવે છે અને ન્યુક્લિયોસાઇડ સંશ્લેષણ અને ડીએનએ પ્રતિકૃતિ સાથે ઓન્ટોલોજીકલ જોડાણ દર્શાવે છે, જે રોગોમાં કોષોના ઉન્નત પ્રસારને સૂચવે છે. એકંદરે, આ તારણો ગ્લિયલ મોડ્યુલોના એલિવેશનને સમર્થન આપે છે જે આપણે અગાઉ એડી નેટવર્ક પ્રોટીઓમ (13, 17) માં અવલોકન કર્યું છે. હાલમાં એવું જાણવા મળ્યું છે કે નેટવર્કમાં ઘણા AD-સંબંધિત ગ્લિયલ મોડ્યુલો નિયંત્રણ અને PD કેસોમાં નીચા અભિવ્યક્તિ સ્તરો દર્શાવે છે, તેમની રોગની વિશિષ્ટતાને પ્રકાશિત કરે છે જે AD (આકૃતિ S2C) માં એલિવેટેડ છે.
અમારા નેટવર્ક પ્રોટીઓમમાં માત્ર ચાર મોડ્યુલો (M1, M3, M10, અને M32) AD પેથોલોજી (P <0.05) (આકૃતિ 2, B અને C) સાથે મજબૂત રીતે નકારાત્મક રીતે સંકળાયેલા છે. M1 અને M3 બંને ન્યુરોનલ માર્કર્સથી સમૃદ્ધ છે. M1 એ સિનેપ્ટિક સંકેતો સાથે ખૂબ જ સંબંધિત છે, જ્યારે M3 એ મિટોકોન્ડ્રીયલ કાર્ય સાથે ગાઢ રીતે સંબંધિત છે. M10 અને M32 માટે સેલ પ્રકાર સંવર્ધનના કોઈ પુરાવા નથી. M32 M3 અને સેલ મેટાબોલિઝમ વચ્ચેના જોડાણને પ્રતિબિંબિત કરે છે, જ્યારે M10 સેલ વૃદ્ધિ અને માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ફંક્શન સાથે ખૂબ જ સંબંધિત છે. AD ની સરખામણીમાં, તમામ ચાર મોડ્યુલો નિયંત્રણ અને PD માં વધારો કરે છે, જે તેમને રોગ-વિશિષ્ટ AD ફેરફારો (આકૃતિ S2C) આપે છે. એકંદરે, આ પરિણામો ન્યુરોન-સમૃદ્ધ મોડ્યુલોની ઘટેલી વિપુલતાને સમર્થન આપે છે જે આપણે અગાઉ એડી (13, 17) માં અવલોકન કર્યું છે. સારાંશમાં, મગજના પ્રોટીઓમનું નેટવર્ક વિશ્લેષણ કે જે અમે શોધ્યું તે અમારા અગાઉના તારણો સાથે સુસંગત AD-ખાસ કરીને બદલાયેલા મોડ્યુલોનું ઉત્પાદન કરે છે.
AD એ પ્રારંભિક એસિમ્પટમેટિક સ્ટેજ (AsymAD) દ્વારા વર્ગીકૃત થયેલ છે, જેમાં વ્યક્તિઓ ક્લિનિકલ જ્ઞાનાત્મક ઘટાડો (5, 31) વિના એમીલોઇડ સંચય દર્શાવે છે. આ એસિમ્પટમેટિક સ્ટેજ પ્રારંભિક તપાસ અને હસ્તક્ષેપ માટે એક મહત્વપૂર્ણ વિન્ડો રજૂ કરે છે. અમે અગાઉ સ્વતંત્ર ડેટા સેટ્સ (13, 17) માં AsymAD અને AD મગજ નેટવર્ક પ્રોટીઓમનું મજબૂત મોડ્યુલર સંરક્ષણ દર્શાવ્યું છે. અમે હાલમાં શોધ્યું છે તે મગજ નેટવર્ક આ અગાઉના તારણો સાથે સુસંગત છે તેની ખાતરી કરવા માટે, અમે 27 DLPFC સંસ્થાઓના પ્રતિકૃતિ ડેટા સેટમાં 44 મોડ્યુલની જાળવણીનું વિશ્લેષણ કર્યું. આ સંસ્થાઓમાં નિયંત્રણ (n = 10), AsymAD (n = 8) અને AD (n = 9) કેસોનો સમાવેશ થાય છે. અમારા ડિસ્કવરી બ્રેઈન કોહોર્ટ (ટેબલ S1B) ના પૃથ્થકરણમાં કંટ્રોલ અને એડી સેમ્પલનો સમાવેશ કરવામાં આવ્યો હતો, જ્યારે AsymAD કેસો માત્ર પ્રતિકૃતિ સમૂહમાં અનન્ય હતા. આ AsymAD કેસો પણ Emory Goizueta ADRC મગજ બેંકમાંથી આવ્યા હતા. મૃત્યુ સમયે સમજશક્તિ સામાન્ય હોવા છતાં, એમીલોઇડનું સ્તર અસાધારણ રીતે ઊંચું હતું (મીન CERAD, 2.8 ± 0.5) (ટેબલ S1B).
આ 27 મગજની પેશીઓના TMT-MS વિશ્લેષણના પરિણામે 11,244 પ્રોટીઓમનું પ્રમાણીકરણ થયું. આ અંતિમ ગણતરીમાં ઓછામાં ઓછા 50% નમૂનાઓમાં માત્ર તે જ પ્રોટીનનો સમાવેશ થાય છે. આ નકલ કરાયેલ ડેટા સેટમાં અમારા શોધ મગજ વિશ્લેષણમાં શોધાયેલ 8817 પ્રોટીનમાંથી 8638 (98.0%) છે, અને નિયંત્રણ અને AD સમૂહો વચ્ચે લગભગ 3000 નોંધપાત્ર રીતે બદલાયેલ પ્રોટીન છે (P <0.05, ભિન્નતાના વિશ્લેષણ માટે તુકેની જોડી ટી ટેસ્ટ પછી) ( કોષ્ટક S2F). આ વિભિન્ન રીતે વ્યક્ત કરાયેલ પ્રોટીન પૈકી, 910 એ એડી અને મગજના પ્રોટીઓમ કંટ્રોલ કેસો (P <0.05, ANOVA Tukey જોડી ટી-ટેસ્ટ પછી) વચ્ચે નોંધપાત્ર સ્તરના ફેરફારો પણ દર્શાવ્યા હતા. એ નોંધવું યોગ્ય છે કે આ 910 માર્કર્સ પ્રોટીઓમ (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) (આકૃતિ S3A) વચ્ચેના પરિવર્તનની દિશામાં અત્યંત સુસંગત છે. વધેલા પ્રોટીનમાં, ડેટા સેટ્સ વચ્ચે સૌથી વધુ સુસંગત ફેરફારો સાથેના પ્રોટીન મુખ્યત્વે ગ્લિયાલ-સમૃદ્ધ M5 અને M18 મોડ્યુલો (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 અને GFAP) ના સભ્યો છે. ઘટેલા પ્રોટીનમાં, સૌથી વધુ સુસંગત ફેરફારો ધરાવતા તેઓ લગભગ સંપૂર્ણપણે M1 મોડ્યુલ (NPTX2, VGF, અને RPH3A) ના સભ્યો હતા જે ચેતોપાગમ સાથે સંકળાયેલા હતા. અમે વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ (આકૃતિ S3B) દ્વારા મિડકાઈન (MDK), CD44, સ્ત્રાવિત ફ્રિઝ્ડ-સંબંધિત પ્રોટીન 1 (SFRP1) અને VGF ના AD-સંબંધિત ફેરફારોની વધુ ચકાસણી કરી. મોડ્યુલ જાળવણી વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે મગજના પ્રોટીઓમમાં લગભગ 80% પ્રોટીન મોડ્યુલો (34/44) પ્રતિકૃતિ ડેટા સેટ (z-score> 1.96, FDR સુધારેલ P <0.05) (આકૃતિ S3C) માં નોંધપાત્ર રીતે સાચવવામાં આવ્યા હતા. આમાંના ચૌદ મોડ્યુલો બે પ્રોટીઓમ વચ્ચે ખાસ આરક્ષિત હતા (z-score> 10, FDR સુધારેલ P <1.0 × 10−23). એકંદરે, મગજના પ્રોટીઓમ વચ્ચેના વિભેદક અભિવ્યક્તિ અને મોડ્યુલર રચનામાં સુસંગતતાની ઉચ્ચ ડિગ્રીની શોધ અને પ્રતિકૃતિ એડી ફ્રન્ટલ કોર્ટેક્સ પ્રોટીનમાં ફેરફારોની પ્રજનનક્ષમતાને પ્રકાશિત કરે છે. વધુમાં, તે એ પણ પુષ્ટિ કરે છે કે AsymAD અને વધુ અદ્યતન રોગો ખૂબ સમાન મગજ નેટવર્ક માળખું ધરાવે છે.
મગજની પ્રતિકૃતિ ડેટા સેટમાં વિભેદક અભિવ્યક્તિનું વધુ વિગતવાર વિશ્લેષણ AsymAD અને નિયંત્રણ (P <0.05) (આકૃતિ S3D) વચ્ચે કુલ 151 નોંધપાત્ર રીતે બદલાયેલ પ્રોટીન સહિત AsymAD પ્રોટીન ફેરફારોની નોંધપાત્ર ડિગ્રીને પ્રકાશિત કરે છે. એમીલોઇડ લોડ સાથે સુસંગત, AsymAD અને AD ના મગજમાં APP નોંધપાત્ર રીતે વધ્યું. MAPT ફક્ત AD માં નોંધપાત્ર રીતે બદલાય છે, જે ગૂંચવણોના વધેલા સ્તરો અને જ્ઞાનાત્મક ઘટાડા (5, 7) સાથે તેના જાણીતા સહસંબંધ સાથે સુસંગત છે. ગ્લિયાલ-સમૃદ્ધ મોડ્યુલો (M5 અને M18) AsymAD માં વધેલા પ્રોટીનમાં ખૂબ જ પ્રતિબિંબિત થાય છે, જ્યારે ચેતાકોષ-સંબંધિત M1 મોડ્યુલ AsymAD માં ઘટેલા પ્રોટીનનું સૌથી પ્રતિનિધિ છે. આમાંના ઘણા AsymAD માર્કર્સ લાક્ષાણિક રોગોમાં મોટા ફેરફારો દર્શાવે છે. આ માર્કર્સમાં SMOC1 છે, જે M18 સાથે સંકળાયેલું ગ્લિયલ પ્રોટીન છે, જે મગજની ગાંઠો અને આંખો અને અંગોના વિકાસ સાથે સંકળાયેલું છે (32). MDK એ સેલ વૃદ્ધિ અને એન્જીયોજેનેસિસ (33) સાથે સંબંધિત હેપરિન-બંધનકર્તા વૃદ્ધિ પરિબળ છે, જે M18 ના અન્ય સભ્ય છે. કંટ્રોલ ગ્રૂપની સરખામણીમાં, AsymAD નોંધપાત્ર રીતે વધ્યું, ત્યારબાદ AD માં વધુ વધારો થયો. તેનાથી વિપરીત, સિનેપ્ટિક પ્રોટીન ન્યુરોપેન્ટ્રેક્સિન 2 (NPTX2) AsymAD મગજમાં નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડો થયો હતો. NPTX2 અગાઉ ન્યુરોડિજનરેશન સાથે સંકળાયેલું હતું અને ઉત્તેજક ચેતોપાગમ (34) માં મધ્યસ્થી કરવામાં તેની માન્ય ભૂમિકા છે. એકંદરે, આ પરિણામો એ.ડી.માં વિવિધ પ્રીક્લિનિકલ પ્રોટીન ફેરફારો દર્શાવે છે જે રોગની તીવ્રતા સાથે પ્રગતિ કરે છે.
મગજ પ્રોટીઓમની શોધમાં અમે પ્રોટીન કવરેજની નોંધપાત્ર ઊંડાણ હાંસલ કરી છે તે જોતાં, અમે નેટવર્ક-લેવલ AD ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ સાથે તેના ઓવરલેપને વધુ સંપૂર્ણ રીતે સમજવાનો પ્રયાસ કરી રહ્યા છીએ. તેથી, અમે AD (n = 308) અને નિયંત્રણ (n = 157) DLPFC પેશીઓ (13) માં 18,204 જનીનોના માઇક્રોએરે માપનમાંથી અગાઉ જનરેટ કરેલા મોડ્યુલ સાથે અમે શોધેલા મગજના પ્રોટીઓમની સરખામણી કરી. ઓવરલેપિંગ કુલ મળીને, અમે 20 અલગ-અલગ આરએનએ મોડ્યુલો ઓળખ્યા, જેમાંથી ઘણાએ ચોક્કસ પ્રકારના કોષોના સંવર્ધનનું નિદર્શન કર્યું, જેમાં ચેતાકોષો, ઓલિગોડેન્ડ્રોસાઇટ્સ, એસ્ટ્રોસાઇટ્સ અને માઇક્રોગ્લિયા (આકૃતિ 3A)નો સમાવેશ થાય છે. AD માં આ મોડ્યુલોના બહુવિધ ફેરફારો આકૃતિ 3B માં દર્શાવવામાં આવ્યા છે. અમારા અગાઉના પ્રોટીન-આરએનએ ઓવરલેપ પૃથ્થકરણ સાથે અનુરૂપ ડીપ અનલેબલેડ એમએસ પ્રોટીઓમ (લગભગ 3000 પ્રોટીન) (13), મગજના પ્રોટીઓમ નેટવર્કમાંના 44 મોડ્યુલોમાંથી મોટાભાગના ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ નેટવર્કમાં છે. તેમાં પણ કોઈ નોંધપાત્ર ઓવરલેપ નથી. અમારી શોધ અને 34 પ્રોટીન મોડ્યુલોની નકલ કે જે મગજના પ્રોટીઓમમાં ખૂબ જ જાળવી રાખવામાં આવે છે, માત્ર 14 (~40%) ફિશરની ચોક્કસ કસોટી (FET) પાસ કરી હતી, જે ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ (આકૃતિ 3A) સાથે આંકડાકીય રીતે નોંધપાત્ર ઓવરલેપ હોવાનું સાબિત થયું હતું. DNA ડેમેજ રિપેર (P-M25 અને P-M19), પ્રોટીન ટ્રાન્સલેશન (P-M7 અને P-M20), RNA બાઈન્ડિંગ/સ્પ્લિસિંગ (P-M16 અને P-M21) અને પ્રોટીન લક્ષ્યીકરણ (P-M13 અને P-) સાથે સુસંગત. M23) ટ્રાન્સક્રિપ્ટમમાં મોડ્યુલો સાથે ઓવરલેપ થતું નથી. તેથી, વર્તમાન ઓવરલેપ વિશ્લેષણ (13)માં ઊંડા પ્રોટીઓમ ડેટા સેટનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હોવા છતાં, મોટાભાગના AD નેટવર્ક પ્રોટીઓમ ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ નેટવર્ક સાથે મેપ થયેલ નથી.
(A) હાઇપરજીઓમેટ્રિક FET એ AD ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ (ટોચ) ના RNA મોડ્યુલમાં સેલ પ્રકાર-વિશિષ્ટ માર્કર્સના સંવર્ધન અને AD મગજના RNA (x-axis) અને પ્રોટીન (y-axis) મોડ્યુલો વચ્ચે ઓવરલેપની ડિગ્રી દર્શાવે છે. (નીચે). લાલ શેડિંગની તીવ્રતા ટોચની પેનલમાં સેલ પ્રકારોના સંવર્ધનની ડિગ્રી અને નીચેની પેનલમાં મોડ્યુલોના ઓવરલેપની તીવ્રતા દર્શાવે છે. ફૂદડી આંકડાકીય મહત્વ દર્શાવે છે (P <0.05). (B) દરેક ટ્રાન્સક્રિપ્ટમ મોડ્યુલ અને AD સ્થિતિના લાક્ષણિક જનીનો વચ્ચેના સહસંબંધની ડિગ્રી. ડાબી બાજુના મોડ્યુલો એડી (વાદળી) સાથે સૌથી વધુ નકારાત્મક રીતે સંકળાયેલા છે અને જમણી બાજુના મોડ્યુલો એડી (લાલ) સાથે સૌથી વધુ સકારાત્મક રીતે સંબંધિત છે. લોગ-રૂપાંતરિત BH-સુધારેલ P મૂલ્ય દરેક સહસંબંધના આંકડાકીય મહત્વની ડિગ્રી સૂચવે છે. (C) શેર્ડ સેલ પ્રકાર સંવર્ધન સાથે નોંધપાત્ર ઓવરલેપિંગ મોડ્યુલો. (D) ઓવરલેપિંગ મોડ્યુલમાં લેબલ થયેલ પ્રોટીન (x-axis) અને RNA (y-axis) ના log2 ફોલ્ડ ફેરફારનું સહસંબંધ વિશ્લેષણ. સંબંધિત P મૂલ્ય સાથે પીયર્સન સહસંબંધ ગુણાંક પ્રદર્શિત થાય છે. માઇક્રો, માઇક્રોગ્લિયા; અવકાશી પદાર્થો, એસ્ટ્રોસાયટ્સ. સીટી, નિયંત્રણ.
મોટાભાગના ઓવરલેપિંગ પ્રોટીન અને આરએનએ મોડ્યુલ્સ સમાન કોષ પ્રકાર સંવર્ધન રૂપરેખાઓ અને સાતત્યપૂર્ણ AD ફેરફાર દિશાઓ (આકૃતિ 3, B અને C) શેર કરે છે. બીજા શબ્દોમાં કહીએ તો, મગજના પ્રોટીઓમ (PM​1) ના સિનેપ્સ-સંબંધિત M1 મોડ્યુલને ત્રણ ન્યુરોનલ-સમૃદ્ધ હોમોલોગસ આરએનએ મોડ્યુલ્સ (R-M1, R-M9 અને R-M16) સાથે મેપ કરવામાં આવે છે, જે AD બંને દર્શાવે છે. ઘટાડો સ્તર. એ જ રીતે, ગ્લિયાલ-સમૃદ્ધ M5 અને M18 પ્રોટીન મોડ્યુલો એસ્ટ્રોસાઇટ્સ અને માઇક્રોગ્લિયલ માર્કર્સ (R-M3, R-M7, અને R-M10)થી સમૃદ્ધ RNA મોડ્યુલો સાથે ઓવરલેપ થાય છે અને રોગોના વધારામાં ખૂબ સામેલ છે. બે ડેટા સેટ વચ્ચેની આ વહેંચાયેલ મોડ્યુલર સુવિધાઓ કોષના પ્રકાર સંવર્ધન અને મગજના પ્રોટીઓમમાં અમે જોયેલા રોગ-સંબંધિત ફેરફારોને વધુ સમર્થન આપે છે. જો કે, અમે આ વહેંચાયેલ મોડ્યુલોમાં વ્યક્તિગત માર્કર્સના RNA અને પ્રોટીન સ્તરો વચ્ચે ઘણા નોંધપાત્ર તફાવતો જોયા છે. આ ઓવરલેપિંગ મોડ્યુલો (આકૃતિ 3D) ની અંદરના પ્રોટીઓમિક્સ અને ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક્સના વિભેદક અભિવ્યક્તિનું સહસંબંધ વિશ્લેષણ આ અસંગતતાને પ્રકાશિત કરે છે. ઉદાહરણ તરીકે, એપીપી અને અન્ય કેટલાક ગ્લિયલ મોડ્યુલ પ્રોટીન (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 અને SFRP1) એ AD પ્રોટીઓમમાં નોંધપાત્ર વધારો દર્શાવ્યો હતો, પરંતુ AD ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમમાં લગભગ કોઈ ફેરફાર થયો ન હતો. આ પ્રોટીન-વિશિષ્ટ ફેરફારો એમિલોઇડ તકતીઓ (23, 35) સાથે નજીકથી સંબંધિત હોઈ શકે છે, જે પ્રોટીઓમને પેથોલોજીકલ ફેરફારોના સ્ત્રોત તરીકે પ્રકાશિત કરે છે, અને આ ફેરફારો ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમમાં પ્રતિબિંબિત થઈ શકતા નથી.
અમે શોધેલા મગજ અને CSF પ્રોટીઓમનું સ્વતંત્ર રીતે વિશ્લેષણ કર્યા પછી, અમે મગજ નેટવર્કના પેથોફિઝિયોલોજીથી સંબંધિત AD CSF બાયોમાર્કર્સને ઓળખવા માટે બે ડેટા સેટનું વ્યાપક વિશ્લેષણ કર્યું. આપણે પહેલા બે પ્રોટીઓમના ઓવરલેપને વ્યાખ્યાયિત કરવું જોઈએ. જો કે તે વ્યાપકપણે સ્વીકારવામાં આવ્યું છે કે CSF એ એડી મગજમાં ન્યુરોકેમિકલ ફેરફારોને પ્રતિબિંબિત કરે છે (4), એડી મગજ અને CSF પ્રોટીઓમ વચ્ચે ઓવરલેપની ચોક્કસ ડિગ્રી અસ્પષ્ટ છે. અમારા બે પ્રોટીઓમમાં શોધાયેલ વહેંચાયેલ જનીન ઉત્પાદનોની સંખ્યાની તુલના કરીને, અમને જાણવા મળ્યું કે મગજમાં લગભગ 70% (n = 1936) પ્રોટીનની ઓળખ મગજમાં પણ કરવામાં આવી હતી (આકૃતિ 4A). આમાંના મોટાભાગના ઓવરલેપિંગ પ્રોટીન (n = 1721) ને ડિસ્કવરી બ્રેઈન ડેટા સેટ (આકૃતિ 4B)માંથી 44 સહ-અભિવ્યક્તિ મોડ્યુલોમાંથી એક સાથે મેપ કરવામાં આવે છે. અપેક્ષા મુજબ, છ સૌથી મોટા મગજ મોડ્યુલો (M1 થી M6) એ CSF ઓવરલેપની સૌથી મોટી માત્રા પ્રદર્શિત કરી. જો કે, ત્યાં નાના મગજ મોડ્યુલો છે (ઉદાહરણ તરીકે, M15 અને M29) જે અણધારી રીતે ઉચ્ચ ડિગ્રી ઓવરલેપ હાંસલ કરે છે, જે મગજના મોડ્યુલ તેના કદ કરતા બમણા મોટા હોય છે. આ અમને મગજ અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી વચ્ચેના ઓવરલેપની ગણતરી કરવા માટે વધુ વિગતવાર, આંકડાકીય રીતે સંચાલિત પદ્ધતિ અપનાવવા પ્રેરિત કરે છે.
(A અને B) શોધ મગજ અને CSF ડેટા સેટમાં શોધાયેલ પ્રોટીન ઓવરલેપ થાય છે. આમાંના મોટાભાગના ઓવરલેપિંગ પ્રોટીન મગજના સહ-અભિવ્યક્તિ નેટવર્કના 44 સહ-અભિવ્યક્તિ મોડ્યુલોમાંથી એક સાથે સંકળાયેલા છે. (C) સેરેબ્રોસ્પાઇનલ ફ્લુઇડ પ્રોટીઓમ અને મગજ નેટવર્ક પ્રોટીઓમ વચ્ચેના ઓવરલેપને શોધો. હીટ મેપની દરેક પંક્તિ હાઇપરજીઓમેટ્રિક FET ના અલગ ઓવરલેપ વિશ્લેષણનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે. ટોચની પંક્તિ મગજના મોડ્યુલ અને સમગ્ર CSF પ્રોટીઓમ વચ્ચે ઓવરલેપ (ગ્રે/બ્લેક શેડિંગ) દર્શાવે છે. બીજી લાઇન દર્શાવે છે કે મગજના મોડ્યુલો અને CSF પ્રોટીન (લાલ રંગમાં છાંયો) વચ્ચેનો ઓવરલેપ એડી (P <0.05) માં નોંધપાત્ર રીતે ઉપર-નિયંત્રિત છે. ત્રીજી પંક્તિ બતાવે છે કે મગજ મોડ્યુલ્સ અને CSF પ્રોટીન (વાદળી શેડિંગ) વચ્ચેનો ઓવરલેપ એડી (P <0.05) માં નોંધપાત્ર રીતે ડાઉન-રેગ્યુલેટેડ છે. FET માંથી મેળવેલા P મૂલ્યને સુધારવા માટે BH પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરો. (D) સેલ પ્રકાર એસોસિએશન અને સંબંધિત GO શરતો પર આધારિત ફોલ્ડિંગ મોડ્યુલ પેનલ. આ પેનલ્સમાં કુલ 271 મગજ સંબંધિત પ્રોટીન હોય છે, જે CSF પ્રોટીઓમમાં અર્થપૂર્ણ વિભેદક અભિવ્યક્તિ ધરાવે છે.
સિંગલ-ટેલ્ડ FET નો ઉપયોગ કરીને, અમે CSF પ્રોટીઓમ અને વ્યક્તિગત મગજ મોડ્યુલો વચ્ચે પ્રોટીન ઓવરલેપના મહત્વનું મૂલ્યાંકન કર્યું. વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે CSF ડેટા સેટમાં કુલ 14 મગજ મોડ્યુલો આંકડાકીય રીતે નોંધપાત્ર ઓવરલેપ્સ ધરાવે છે (FDR એડજસ્ટેડ P <0.05), અને એક વધારાનું મોડ્યુલ (M18) જેનું ઓવરલેપ મહત્વની નજીક છે (FDR એડજસ્ટેડ P = 0.06) (આકૃતિ 4C) , ટોચની પંક્તિ). અમે એવા મોડ્યુલોમાં પણ રસ ધરાવીએ છીએ જે અલગ રીતે વ્યક્ત CSF પ્રોટીન સાથે મજબૂત રીતે ઓવરલેપ થાય છે. તેથી, અમે એ નક્કી કરવા માટે બે વધારાના FET વિશ્લેષણો લાગુ કર્યા કે કયા (i) CSF પ્રોટીનમાં AD માં નોંધપાત્ર વધારો થયો હતો અને (ii) CSF પ્રોટીન AD માં નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડો થયો હતો (P <0.05, જોડી ટી ટેસ્ટ એડી/નિયંત્રણ) અર્થપૂર્ણ ઓવરલેપ સાથે મગજ મોડ્યુલો. તેમની વચ્ચે. આકૃતિ 4C ની મધ્ય અને નીચેની પંક્તિઓમાં બતાવ્યા પ્રમાણે, આ વધારાના વિશ્લેષણો દર્શાવે છે કે 44 મગજ મોડ્યુલમાંથી 8 એડી CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 અને M38) માં ઉમેરાયેલા પ્રોટીન સાથે નોંધપાત્ર રીતે ઓવરલેપ થાય છે. . ), જ્યારે માત્ર બે મોડ્યુલો (M6 અને M15) એ AD CSF માં ઘટેલા પ્રોટીન સાથે અર્થપૂર્ણ ઓવરલેપ દર્શાવ્યું હતું. અપેક્ષા મુજબ, તમામ 10 મોડ્યુલો CSF પ્રોટીઓમ સાથે સૌથી વધુ ઓવરલેપ સાથે 15 મોડ્યુલમાં છે. તેથી, અમે ધારીએ છીએ કે આ 15 મોડ્યુલો એડી મગજમાંથી મેળવેલા CSF બાયોમાર્કર્સના ઉચ્ચ ઉપજ સ્ત્રોત છે.
અમે આ 15 ઓવરલેપિંગ મોડ્યુલોને WGCNA ટ્રી ડાયાગ્રામમાં તેમની નિકટતા અને કોષના પ્રકારો અને જનીન ઓન્ટોલોજી (આકૃતિ 4D) સાથેના તેમના જોડાણના આધારે પાંચ મોટા પ્રોટીન પેનલમાં ફોલ્ડ કર્યા છે. પ્રથમ પેનલમાં ન્યુરોન માર્કર્સ અને સિનેપ્સ-સંબંધિત પ્રોટીન (M1 અને M12) સમૃદ્ધ મોડ્યુલો છે. સિનેપ્ટિક પેનલમાં કુલ 94 પ્રોટીન હોય છે, અને CSF પ્રોટીઓમમાં સ્તર નોંધપાત્ર રીતે બદલાયું છે, જે તેને પાંચ પેનલમાં મગજ સંબંધિત CSF માર્કર્સનો સૌથી મોટો સ્ત્રોત બનાવે છે. બીજા જૂથ (M6 અને M15) એ એન્ડોથેલિયલ સેલ માર્કર્સ અને વેસ્ક્યુલર બોડી સાથે ગાઢ જોડાણ દર્શાવ્યું, જેમ કે "ઘા હીલિંગ" (M6) અને "હ્યુમરલ ઇમ્યુન રિસ્પોન્સનું નિયમન" (M15). M15 લિપોપ્રોટીન ચયાપચય સાથે પણ ખૂબ જ સંબંધિત છે, જે એન્ડોથેલિયમ (36) સાથે નજીકથી સંબંધિત છે. વેસ્ક્યુલર પેનલમાં મગજ સાથે સંબંધિત 34 CSF માર્કર્સ હોય છે. ત્રીજા જૂથમાં મોડ્યુલો (M2 અને M4) નો સમાવેશ થાય છે જે નોંધપાત્ર રીતે ઓલિગોડેન્ડ્રોસાઇટ માર્કર્સ અને સેલ પ્રસાર સાથે સંબંધિત છે. ઉદાહરણ તરીકે, M2 ના ઉચ્ચ-સ્તરના ઓન્ટોલોજી શબ્દોમાં "DNA પ્રતિકૃતિનું હકારાત્મક નિયમન" અને "પ્યુરિન બાયોસિન્થેસિસ પ્રક્રિયા" નો સમાવેશ થાય છે. દરમિયાન, M4 માં "ગ્લિયલ સેલ ડિફરન્સિએશન" અને "ક્રોમોસોમ સેગ્રિગેશન" નો સમાવેશ થાય છે. માઇલિનેશન પેનલમાં મગજ સાથે સંબંધિત 49 CSF માર્કર હોય છે.
ચોથા જૂથમાં સૌથી વધુ મોડ્યુલો (M30, M29, M18, M24, અને M5) છે, અને લગભગ તમામ મોડ્યુલો માઇક્રોગ્લિયા અને એસ્ટ્રોસાઇટ માર્કર્સમાં નોંધપાત્ર રીતે સમૃદ્ધ છે. માઇલિનેશન પેનલની જેમ, ચોથા પેનલમાં મોડ્યુલો (M30, M29, અને M18) પણ છે જે સેલ પ્રસાર સાથે ગાઢ રીતે સંબંધિત છે. આ જૂથના અન્ય મોડ્યુલો રોગપ્રતિકારક પરિભાષા સાથે ખૂબ જ સંબંધિત છે, જેમ કે "ઇમ્યુન ઇફેક્ટ પ્રોસેસ" (M5) અને "ઇમ્યુન રિસ્પોન્સ રેગ્યુલેશન" (M24). ગ્લિયલ રોગપ્રતિકારક જૂથમાં મગજ સાથે સંબંધિત 42 CSF માર્કર્સ હોય છે. છેલ્લે, છેલ્લી પેનલમાં ચાર મોડ્યુલ (M44, M3, M33 અને M38) પર મગજને લગતા 52 માર્કર્સનો સમાવેશ થાય છે, જે તમામ ઊર્જા સંગ્રહ અને ચયાપચય સાથે સંબંધિત શરીર પર હોય છે. આ મોડ્યુલોમાંથી સૌથી મોટું (M3) મિટોકોન્ડ્રિયા સાથે ગાઢ રીતે સંબંધિત છે અને તે ન્યુરોન-વિશિષ્ટ માર્કર્સથી સમૃદ્ધ છે. M38 આ મેટાબોલોમના નાના મોડ્યુલ સભ્યોમાંનું એક છે અને તે મધ્યમ ચેતાકોષની વિશિષ્ટતા પણ દર્શાવે છે.
એકંદરે, આ પાંચ પેનલ એડી કોર્ટેક્સમાં કોષના પ્રકારો અને કાર્યોની વિશાળ શ્રેણીને પ્રતિબિંબિત કરે છે, અને સામૂહિક રીતે 271 મગજ-સંબંધિત CSF માર્કર (ટેબલ S2G) ધરાવે છે. આ MS પરિણામોની માન્યતાનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે, અમે મલ્ટિપ્લેક્સિંગ ક્ષમતાઓ, ઉચ્ચ સંવેદનશીલતા અને વિશિષ્ટતા સાથેની ઓર્થોગોનલ એન્ટિબોડી-આધારિત તકનીક, પ્રોક્સિમિટી એક્સ્ટેંશન એસે (PEA) નો ઉપયોગ કર્યો અને અમને આ 271 બાયોમાર્કર્સનો સબસેટ મળ્યો, સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીના નમૂનાઓનું પુનઃવિશ્લેષણ કર્યું. (n = 36). આ 36 લક્ષ્યો PEA ના AD મલ્ટિપલમાં ફેરફાર દર્શાવે છે, જે અમારા MS-આધારિત તારણો (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12) સાથે ગાઢ રીતે સંબંધિત છે, જે અમારા વ્યાપક MS વિશ્લેષણના પરિણામોની મજબૂતીથી ચકાસણી કરે છે (આકૃતિ S4 ).
અમારા પાંચ જૂથો દ્વારા ભાર મૂકવામાં આવેલ જૈવિક થીમ્સ, સિનેપ્ટિક સિગ્નલિંગથી લઈને ઉર્જા ચયાપચય સુધી, તમામ એડી (1-3) ના પેથોજેનેસિસ સાથે સંબંધિત છે. તેથી, આ પેનલ્સ ધરાવતા તમામ 15 મોડ્યુલો મગજના પ્રોટીઓમમાં AD પેથોલોજી સાથે સંબંધિત છે જે આપણે શોધ્યું છે (આકૃતિ 2B). અમારા ગ્લિયાલ મોડ્યુલો વચ્ચેનો ઉચ્ચ હકારાત્મક રોગવિજ્ઞાન સંબંધી સંબંધ અને આપણા સૌથી મોટા ન્યુરોનલ મોડ્યુલો (M1 અને M3) વચ્ચેનો મજબૂત નકારાત્મક રોગવિજ્ઞાન સંબંધી સંબંધ સૌથી વધુ નોંધપાત્ર છે. અમારા પ્રતિકૃતિ મગજ પ્રોટીઓમ (આકૃતિ S3D) નું વિભેદક અભિવ્યક્તિ વિશ્લેષણ પણ M5 અને M18-પ્રાપ્ત ગ્લિયાલ પ્રોટીનને પ્રકાશિત કરે છે. AsymAD અને સિમ્પ્ટોમેટિક AD માં, સૌથી વધુ વધેલા ગ્લિયાલ પ્રોટીન અને M1-સંબંધિત સિનેપ્સમાં પ્રોટીન સૌથી વધુ ઘટે છે. આ અવલોકનો સૂચવે છે કે અમે પાંચ જૂથોમાં ઓળખેલા 271 સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી માર્કર્સ એડી કોર્ટેક્સમાં રોગ પ્રક્રિયાઓ સાથે સંબંધિત છે, જેમાં પ્રારંભિક એસિમ્પટમેટિક તબક્કામાં થાય છે તે સહિત.
મગજ અને કરોડરજ્જુના પ્રવાહીમાં પેનલ પ્રોટીનની બદલાવની દિશાનું વધુ સારી રીતે પૃથ્થકરણ કરવા માટે, અમે દરેક 15 ઓવરલેપિંગ મોડ્યુલો માટે નીચેની બાબતો દોરી: (i) મગજ ડેટા સેટમાં મોડ્યુલ વિપુલતા સ્તર અને (ii) મોડ્યુલ પ્રોટીન તફાવત સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીમાં દર્શાવવામાં આવે છે (આકૃતિ S5). અગાઉ સૂચવ્યા મુજબ, WGCNA નો ઉપયોગ મગજમાં મોડ્યુલની વિપુલતા અથવા લાક્ષણિક પ્રોટીન મૂલ્ય નક્કી કરવા માટે થાય છે (13). જ્વાળામુખી નકશાનો ઉપયોગ સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી (AD/નિયંત્રણ) માં મોડ્યુલર પ્રોટીનની વિભેદક અભિવ્યક્તિનું વર્ણન કરવા માટે થાય છે. આ આંકડા દર્શાવે છે કે પાંચમાંથી ત્રણ પેનલ મગજ અને કરોડરજ્જુના પ્રવાહીમાં જુદા જુદા અભિવ્યક્તિ વલણો દર્શાવે છે. સિનેપ્સ પેનલના બે મોડ્યુલો (M1 અને M12) એડી મગજમાં વિપુલતાના સ્તરમાં ઘટાડો દર્શાવે છે, પરંતુ એડી CSF (આકૃતિ S5A) માં વધેલા પ્રોટીન સાથે નોંધપાત્ર રીતે ઓવરલેપ થાય છે. મેટાબોલોમ (M3 અને M38) ધરાવતા ચેતાકોષ-સંબંધિત મોડ્યુલો સમાન મગજ અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી અભિવ્યક્તિ પેટર્ન અસંગત દર્શાવે છે (આકૃતિ S5E). વેસ્ક્યુલર પેનલે વિવિધ અભિવ્યક્તિ વલણો પણ દર્શાવ્યા હતા, જો કે તેના મોડ્યુલો (M6 અને M15) AD મગજમાં સાધારણ રીતે વધ્યા હતા અને રોગગ્રસ્ત CSF (આકૃતિ S5B) માં ઘટાડો થયો હતો. બાકીની બે પેનલમાં મોટા ગ્લિયલ નેટવર્ક્સ હોય છે જેમના પ્રોટીન બંને કમ્પાર્ટમેન્ટમાં સતત ઉપર-નિયમિત હોય છે (આકૃતિ S5, C અને D).
મહેરબાની કરીને નોંધ કરો કે આ વલણો આ પેનલ્સમાંના તમામ માર્કર્સ માટે સામાન્ય નથી. ઉદાહરણ તરીકે, સિનેપ્ટિક પેનલમાં ઘણા પ્રોટીનનો સમાવેશ થાય છે જે AD મગજ અને CSF (આકૃતિ S5A) માં નોંધપાત્ર રીતે ઘટે છે. આ ડાઉન-રેગ્યુલેટેડ સેરેબ્રોસ્પાઇનલ ફ્લુઇડ માર્કર્સમાં M1નું NPTX2 અને VGF અને M12નું ક્રોમોગ્રેનિન B છે. જો કે, આ અપવાદો હોવા છતાં, આપણા મોટાભાગના સિનેપ્ટિક માર્કર્સ એડી સ્પાઇનલ પ્રવાહીમાં એલિવેટેડ છે. એકંદરે, આ વિશ્લેષણો અમારા પાંચ પેનલમાંના દરેકમાં મગજ અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીના સ્તરોમાં આંકડાકીય રીતે નોંધપાત્ર વલણોને અલગ પાડવામાં સક્ષમ હતા. આ વલણો AD માં મગજ અને CSF પ્રોટીન અભિવ્યક્તિ વચ્ચેના જટિલ અને ઘણીવાર અલગ સંબંધને પ્રકાશિત કરે છે.
તે પછી, અમે બાયોમાર્કર્સના અમારા 271 સેટને સૌથી વધુ આશાસ્પદ અને પુનઃઉત્પાદન કરી શકાય તેવા લક્ષ્યો (આકૃતિ 5A) સુધી સંકુચિત કરવા માટે ઉચ્ચ-થ્રુપુટ MS પ્રતિકૃતિ વિશ્લેષણ (CSF પ્રતિકૃતિ 1) નો ઉપયોગ કર્યો. CSF નકલ 1 એ એમોરી ગોઇઝ્યુએટા ADRC ના કુલ 96 નમૂનાઓ ધરાવે છે, જેમાં નિયંત્રણ, AsymAD અને AD કોહોર્ટ (ટેબલ S1A)નો સમાવેશ થાય છે. આ એડી કેસો હળવા જ્ઞાનાત્મક ઘટાડા દ્વારા વર્ગીકૃત થયેલ છે (એટલે ​​કે MoCA, 20.0 ± 3.8), અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી (ટેબલ S1A) માં પુષ્ટિ થયેલ AD બાયોમાર્કર્સમાં ફેરફાર. અમને મળેલા CSF વિશ્લેષણથી વિપરીત, આ પ્રતિકૃતિ વધુ કાર્યક્ષમ અને ઉચ્ચ-થ્રુપુટ "સિંગલ-શોટ" MS પદ્ધતિ (ઓફ-લાઇન ફ્રેક્શનેશન વિના) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવે છે, જેમાં એક સરળ નમૂના તૈયારી પ્રોટોકોલનો સમાવેશ થાય છે જે વ્યક્તિગત નમૂનાઓની રોગપ્રતિકારક શક્તિની જરૂરિયાતને દૂર કરે છે. . તેના બદલે, ઓછા વિપુલ પ્રોટીન (37) ના સિગ્નલને વિસ્તૃત કરવા માટે એક જ રોગપ્રતિકારક શક્તિ-ક્ષમ "ઉન્નતીકરણ ચેનલ" નો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે. જો કે તે કુલ પ્રોટીઓમ કવરેજને ઘટાડે છે, આ સિંગલ-શોટ પદ્ધતિ નોંધપાત્ર રીતે મશીનનો સમય ઘટાડે છે અને TMT-લેબલવાળા નમૂનાઓની સંખ્યામાં વધારો કરે છે જેનું વિશ્લેષણ કરી શકાય છે (17, 38). કુલ મળીને, પૃથ્થકરણમાં 6,487 પેપ્ટાઈડ્સની ઓળખ થઈ, જે 96 કેસોમાં 1,183 પ્રોટીઓમ પર મેપ કરવામાં આવી. CSF પૃથ્થકરણની જેમ અમને જાણવા મળ્યું છે કે, ઓછામાં ઓછા 50% નમૂનાઓમાં માત્ર તે જ પ્રોટીનની માત્રાને અનુગામી ગણતરીઓમાં સમાવવામાં આવી હતી, અને ડેટાને ઉંમર અને લિંગની અસરો માટે પાછો ખેંચવામાં આવ્યો હતો. આનાથી 792 પ્રોટીઓમનું અંતિમ પ્રમાણીકરણ થયું, જેમાંથી 95% CSF ડેટા સેટમાં પણ ઓળખવામાં આવ્યા હતા.
(A) મગજ-સંબંધિત CSF પ્રોટીન લક્ષ્યો પ્રથમ નકલ કરાયેલ CSF સમૂહમાં ચકાસાયેલ અને અંતિમ પેનલમાં સમાવિષ્ટ છે (n = 60). (B થી E) પેનલ બાયોમાર્કર સ્તરો (કમ્પોઝિટ z-સ્કોર્સ) ચાર CSF પ્રતિકૃતિ સમૂહમાં માપવામાં આવે છે. દરેક પ્રતિકૃતિ વિશ્લેષણમાં વિપુલતામાં થતા ફેરફારોના આંકડાકીય મહત્વના મૂલ્યાંકન માટે તુકીના પોસ્ટ-કરેક્શન સાથે જોડી ટી-ટેસ્ટ્સ અથવા ANOVA નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. સીટી, નિયંત્રણ.
વ્યાપક પૃથ્થકરણ દ્વારા અમારા 271 મગજ-સંબંધિત CSF લક્ષ્યોને ચકાસવામાં અમને ખાસ રસ હોવાથી, અમે આ પ્રતિકૃતિવાળા પ્રોટીઓમની વધુ તપાસને આ માર્કર્સ સુધી મર્યાદિત કરીશું. આ 271 પ્રોટીનમાંથી, 100 CSF પ્રતિકૃતિ 1 માં શોધી કાઢવામાં આવ્યા હતા. આકૃતિ S6A નિયંત્રણ અને AD પ્રતિકૃતિ નમૂનાઓ વચ્ચેના આ 100 ઓવરલેપિંગ માર્કર્સની વિભેદક અભિવ્યક્તિ દર્શાવે છે. AD માં સિનેપ્ટિક અને મેટાબોલાઇટ હિસ્ટોન્સ સૌથી વધુ વધે છે, જ્યારે વેસ્ક્યુલર પ્રોટીન રોગમાં સૌથી વધુ ઘટે છે. મોટાભાગના 100 ઓવરલેપિંગ માર્કર્સ (n = 70) એ બે ડેટા સેટ્સ (આકૃતિ S6B) માં ફેરફારની સમાન દિશા જાળવી રાખી છે. આ 70 માન્ય મગજ-સંબંધિત CSF માર્કર્સ (ટેબલ S2H) મોટે ભાગે અગાઉ અવલોકન કરાયેલ પેનલ અભિવ્યક્તિ વલણોને પ્રતિબિંબિત કરે છે, એટલે કે, વેસ્ક્યુલર પ્રોટીનનું ડાઉન-રેગ્યુલેશન અને અન્ય તમામ પેનલ્સનું અપ-રેગ્યુલેશન. આ 70 માન્ય પ્રોટીનમાંથી માત્ર 10 એ AD વિપુલતામાં ફેરફારો દર્શાવ્યા છે જે આ પેનલ વલણોનો વિરોધાભાસ કરે છે. મગજ અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીના એકંદર વલણને શ્રેષ્ઠ રીતે પ્રતિબિંબિત કરતી પેનલ બનાવવા માટે, અમે રસની પેનલમાંથી આ 10 પ્રોટીનને બાકાત રાખ્યા છે જેની અમે આખરે ચકાસણી કરી છે (આકૃતિ 5A). તેથી, અમારી પેનલમાં આખરે અલગ-અલગ નમૂનાની તૈયારી અને MS પ્લેટફોર્મ વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરીને બે સ્વતંત્ર CSF AD સમૂહમાં ચકાસાયેલ કુલ 60 પ્રોટીનનો સમાવેશ થાય છે. CSF કોપી 1 કંટ્રોલ અને AD કેસમાં આ અંતિમ પેનલ્સના z-સ્કોર અભિવ્યક્તિ પ્લોટ્સે અમને મળેલા CSF સમૂહ (આકૃતિ 5B)માં અવલોકન કરેલ પેનલ વલણની પુષ્ટિ કરે છે.
આ 60 પ્રોટીનમાં, એડી સાથે સંકળાયેલા પરમાણુઓ છે, જેમ કે ઓસ્ટીયોપોન્ટિન (એસપીપી1), જે એક પ્રો-ઈન્ફ્લેમેટરી સાયટોકિન છે જે ઘણા અભ્યાસો (39-41) માં એડી સાથે સંકળાયેલું છે, અને GAP43, એક સિનેપ્ટિક પ્રોટીન જે સ્પષ્ટપણે ન્યુરોડીજનરેશન (42) સાથે જોડાયેલ છે. સૌથી વધુ સંપૂર્ણ રીતે ચકાસાયેલ પ્રોટીન અન્ય ન્યુરોડીજનરેટિવ રોગો, જેમ કે એમ્યોટ્રોફિક લેટરલ સ્ક્લેરોસિસ (ALS) સંબંધિત સુપરઓક્સાઈડ ડિસમ્યુટેઝ 1 (SOD1) અને પાર્કિન્સન રોગ સંબંધિત ડેસાકેરેઝ (PARK7) સંબંધિત માર્કર છે. અમે એ પણ ચકાસ્યું છે કે અન્ય ઘણા માર્કર્સ, જેમ કે SMOC1 અને મગજ-સમૃદ્ધ મેમ્બ્રેન એટેચમેન્ટ સિગ્નલિંગ પ્રોટીન 1 (BASP1), ન્યુરોડિજનરેશન સાથે અગાઉની લિંક્સ મર્યાદિત કરે છે. નોંધનીય છે કે CSF પ્રોટીઓમમાં તેમની ઓછી એકંદર વિપુલતાને લીધે, અમારા માટે MAPT અને અમુક અન્ય AD-સંબંધિત પ્રોટીનને વિશ્વસનીય રીતે શોધવા માટે આ ઉચ્ચ-થ્રુપુટ સિંગલ-શોટ શોધ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરવો મુશ્કેલ છે (ઉદાહરણ તરીકે, NEFL અને NRGN. ) ( 43, 44).
પછી અમે ત્રણ વધારાના પ્રતિકૃતિ વિશ્લેષણમાં આ 60 પ્રાધાન્યતા પેનલ માર્કર્સને તપાસ્યા. CSF કોપી 2 માં, અમે એમોરી ગોઇઝ્યુએટા ADRC (17) ના 297 નિયંત્રણ અને AD નમૂનાઓના સ્વતંત્ર સમૂહનું વિશ્લેષણ કરવા માટે એક TMT-MS નો ઉપયોગ કર્યો. CSF પ્રતિકૃતિ 3 માં 120 કંટ્રોલમાંથી ઉપલબ્ધ TMT-MS ડેટાનું પુનઃવિશ્લેષણ અને લૌઝેન, સ્વિટ્ઝર્લૅન્ડ (45) ના AD દર્દીઓનો સમાવેશ થાય છે. અમે દરેક ડેટાસેટમાં 60 પ્રાથમિકતા માર્કર્સમાંથી બે તૃતીયાંશ કરતાં વધુ શોધી કાઢ્યા છે. જો કે સ્વિસ અભ્યાસમાં વિવિધ MS પ્લેટફોર્મ્સ અને TMT ક્વોન્ટિફિકેશન પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો (45, 46), અમે બે પુનરાવર્તિત વિશ્લેષણ (આકૃતિ 5, C અને D, અને કોષ્ટકો S2, I, અને J)માં અમારા પેનલ વલણોને મજબૂત રીતે પુનઃઉત્પાદિત કર્યા. અમારા જૂથની રોગની વિશિષ્ટતાનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે, અમે ચોથા પ્રતિકૃતિ ડેટા સેટ (CSF પ્રતિકૃતિ 4) નું વિશ્લેષણ કરવા TMT-MS નો ઉપયોગ કર્યો, જેમાં માત્ર નિયંત્રણ (n = 18) અને AD ( n = 17) કેસો જ નહીં, પણ PD ( n = 17) પણ સામેલ છે. n = 14)), ALS (n = 18) અને ફ્રન્ટોટેમ્પોરલ ડિમેન્શિયા (FTD) નમૂનાઓ (n = 11) (કોષ્ટક S1A). અમે આ સમૂહ (60 માંથી 38)માં લગભગ બે-તૃતીયાંશ પેનલ પ્રોટીનનું સફળતાપૂર્વક પ્રમાણીકરણ કર્યું. આ પરિણામો તમામ પાંચ બાયોમાર્કર પેનલમાં AD-વિશિષ્ટ ફેરફારોને પ્રકાશિત કરે છે (આકૃતિ 5E અને કોષ્ટક S2K). ચયાપચય જૂથમાં વધારો એ સૌથી મજબૂત AD વિશિષ્ટતા દર્શાવે છે, ત્યારબાદ માયલિનેશન અને ગ્લિયલ જૂથ. થોડી હદ સુધી, FTD પણ આ પેનલો વચ્ચે વધારો દર્શાવે છે, જે સમાન સંભવિત નેટવર્ક ફેરફારોને પ્રતિબિંબિત કરી શકે છે (17). તેનાથી વિપરિત, ALS અને PD એ નિયંત્રણ જૂથ તરીકે લગભગ સમાન માઇલિનેશન, ગ્લિયલ અને મેટાબોલોમ પ્રોફાઇલ્સ દર્શાવ્યા હતા. એકંદરે, નમૂનાની તૈયારી, MS પ્લેટફોર્મ, અને TMT ક્વોન્ટિફિકેશન પદ્ધતિઓમાં તફાવત હોવા છતાં, આ પુનરાવર્તિત વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે અમારા અગ્રતા પેનલ માર્કર્સ 500 કરતાં વધુ અનન્ય CSF નમૂનાઓમાં અત્યંત સુસંગત AD-વિશિષ્ટ ફેરફારો ધરાવે છે.
જ્ઞાનાત્મક લક્ષણોની શરૂઆતના ઘણા વર્ષો પહેલા એડી ન્યુરોડિજનરેશનને વ્યાપકપણે માન્યતા આપવામાં આવી છે, તેથી AsymAD (5, 31) ના બાયોમાર્કર્સની તાત્કાલિક જરૂર છે. જો કે, વધુ અને વધુ પુરાવાઓ દર્શાવે છે કે AsymAD નું જીવવિજ્ઞાન એકરૂપતાથી દૂર છે, અને જોખમ અને સ્થિતિસ્થાપકતાની જટિલ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા પછીના રોગની પ્રગતિમાં મોટા વ્યક્તિગત તફાવતો તરફ દોરી જાય છે (47). AsymAD કેસોને ઓળખવા માટે ઉપયોગમાં લેવાતા હોવા છતાં, કોર CSF બાયોમાર્કર્સ (Aβ1-42, કુલ tau અને p-tau) ના સ્તરો વિશ્વસનીય રીતે અનુમાન કરવામાં સક્ષમ નથી કે કોણ ઉન્માદ (4, 7) માં પ્રગતિ કરશે, જે સૂચવે છે કે તે વધુ હોઈ શકે છે. આ વસ્તીના જોખમને ચોક્કસ રીતે સ્તરીકરણ કરવા માટે મગજના શરીરવિજ્ઞાનના બહુવિધ પાસાઓ પર આધારિત સર્વગ્રાહી બાયોમાર્કર સાધનોનો સમાવેશ કરવો જરૂરી છે. તેથી, અમે પછીથી CSF નકલ 1 ની AsymAD વસ્તીમાં અમારી AD- માન્ય બાયોમાર્કર પેનલનું વિશ્લેષણ કર્યું. આ 31 AsymAD કેસો અસામાન્ય કોર બાયોમાર્કર સ્તરો (Aβ1–42/કુલ ટાઉ ELISA રેશિયો, <5.5) અને સંપૂર્ણ સમજશક્તિ (મીન MoCA, 27) દર્શાવે છે. ± 2.2) (કોષ્ટક S1A). વધુમાં, AsymAD ધરાવતી તમામ વ્યક્તિઓનો ક્લિનિકલ ડિમેન્શિયા સ્કોર 0 છે, જે દર્શાવે છે કે દૈનિક જ્ઞાનાત્મક અથવા કાર્યાત્મક કામગીરીમાં ઘટાડો થવાના કોઈ પુરાવા નથી.
અમે સૌપ્રથમ AsymAD સમૂહ સહિત તમામ 96 CSF પ્રતિકૃતિઓ 1 માં માન્ય પેનલના સ્તરોનું વિશ્લેષણ કર્યું. અમને જાણવા મળ્યું છે કે AsymAD જૂથમાં ઘણી પેનલ્સમાં AD જેવા વિપુલતાના નોંધપાત્ર ફેરફારો હતા, વેસ્ક્યુલર પેનલે AsymAD માં નીચું વલણ દર્શાવ્યું હતું, જ્યારે અન્ય તમામ પેનલોએ ઉપરનું વલણ દર્શાવ્યું હતું (આકૃતિ 6A). તેથી, તમામ પેનલોએ ELISA Aβ1-42 અને કુલ ટાઉ સ્તરો (આકૃતિ 6B) સાથે અત્યંત નોંધપાત્ર સહસંબંધ દર્શાવ્યો હતો. તેનાથી વિપરીત, જૂથ અને MoCA સ્કોર વચ્ચેનો સહસંબંધ પ્રમાણમાં નબળો છે. આ વિશ્લેષણોમાંથી એક વધુ આકર્ષક તારણો એ એસીએમએડી સમૂહમાં પેનલ વિપુલતાની વિશાળ શ્રેણી છે. આકૃતિ 6A માં બતાવ્યા પ્રમાણે, AsymAD જૂથનું પેનલ સ્તર સામાન્ય રીતે નિયંત્રણ જૂથ અને AD જૂથના પેનલ સ્તરને પાર કરે છે, જે પ્રમાણમાં ઊંચી પરિવર્તનશીલતા દર્શાવે છે. AsymAD ની આ વિજાતીયતાને વધુ અન્વેષણ કરવા માટે, અમે 96 CSF પ્રતિકૃતિ 1 કેસમાં બહુપરીમાણીય સ્કેલિંગ (MDS) વિશ્લેષણ લાગુ કર્યું. MDS પૃથ્થકરણ ડેટા સેટમાં અમુક ચલોના આધારે કેસો વચ્ચેની સમાનતાની કલ્પના કરવાની પરવાનગી આપે છે. આ ક્લસ્ટર વિશ્લેષણ માટે, અમે ફક્ત તે માન્ય પેનલ માર્કર્સનો ઉપયોગ કરીએ છીએ કે જેમાં CSF શોધ અને પ્રતિકૃતિ 1 પ્રોટીઓમ (n = 29) (ટેબલ S2L) સ્તરમાં આંકડાકીય રીતે નોંધપાત્ર ફેરફાર (P <0.05, AD/control) હોય. આ વિશ્લેષણે અમારા નિયંત્રણ અને AD કેસો (આકૃતિ 6C) વચ્ચે સ્પષ્ટ અવકાશી ક્લસ્ટરીંગનું નિર્માણ કર્યું. તેનાથી વિપરીત, કેટલાક AsymAD કેસો સ્પષ્ટપણે નિયંત્રણ જૂથમાં ક્લસ્ટર થયેલ છે, જ્યારે અન્ય AD કેસોમાં સ્થિત છે. આ AsymAD વિજાતીયતાને વધુ અન્વેષણ કરવા માટે, અમે આ AsymAD કેસોના બે જૂથોને વ્યાખ્યાયિત કરવા માટે અમારા MDS નકશાનો ઉપયોગ કર્યો. પ્રથમ જૂથમાં નિયંત્રણ (n = 19) ની નજીક ક્લસ્ટર થયેલ AsymAD કેસોનો સમાવેશ થાય છે, જ્યારે બીજા જૂથમાં AD (n = 12) ની નજીક માર્કર પ્રોફાઇલ સાથે AsymAD કેસોની લાક્ષણિકતા હતી.
(A) AsymAD સહિત CSF પ્રતિકૃતિ 1 સમૂહમાં તમામ 96 નમૂનાઓમાં CSF બાયોમાર્કર જૂથનું અભિવ્યક્તિ સ્તર (z-સ્કોર). પેનલ વિપુલતા ફેરફારોના આંકડાકીય મહત્વનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે તુકીના પોસ્ટ-સુધારણા સાથેના તફાવતના વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. (B) MoCA સ્કોર અને ELISA Aβ1-42 અને CSF નકલ 1 નમૂનાઓમાં કુલ ટાઉ સ્તર સાથે પેનલ પ્રોટીન વિપુલતા સ્તર (z-સ્કોર) નું સહસંબંધ વિશ્લેષણ. સંબંધિત P મૂલ્ય સાથે પીયર્સન સહસંબંધ ગુણાંક પ્રદર્શિત થાય છે. (C) 96 CSF કોપી 1 કેસોના MDS 29 માન્ય પેનલ માર્કર્સના વિપુલતા સ્તરો પર આધારિત હતા, જે શોધ અને CSF કોપી 1 ડેટા સેટ [P <0.05 AD/control (CT)] બંનેમાં નોંધપાત્ર રીતે બદલાયા હતા. આ વિશ્લેષણનો ઉપયોગ AsymAD જૂથને નિયંત્રણ (n = 19) અને AD (n = 12) પેટાજૂથોમાં વિભાજીત કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. (D) જ્વાળામુખી પ્લોટ બે AsymAD પેટાજૂથો વચ્ચેના -log10 આંકડાકીય P મૂલ્યની તુલનામાં log2 ફોલ્ડ ચેન્જ (x-axis) સાથે તમામ CSF પ્રતિકૃતિ 1 પ્રોટીનની વિભેદક અભિવ્યક્તિ દર્શાવે છે. પેનલ બાયોમાર્કર્સ રંગીન છે. (E) CSF પ્રતિકૃતિ 1 પસંદગી જૂથ બાયોમાર્કર્સનું વિપુલતા સ્તર AsymAD પેટાજૂથો વચ્ચે અલગ રીતે વ્યક્ત કરવામાં આવે છે. તુકેના વિભિન્નતાના પોસ્ટ-એડજસ્ટેડ વિશ્લેષણનો ઉપયોગ આંકડાકીય મહત્વના મૂલ્યાંકન માટે કરવામાં આવ્યો હતો.
અમે આ નિયંત્રણ અને AD-જેવા AsymAD કેસો (આકૃતિ 6D અને કોષ્ટક S2L) વચ્ચેના વિભેદક પ્રોટીન અભિવ્યક્તિની તપાસ કરી. પરિણામી જ્વાળામુખી નકશો દર્શાવે છે કે બે જૂથો વચ્ચે 14 પેનલ માર્કર નોંધપાત્ર રીતે બદલાયા છે. આમાંના મોટાભાગના માર્કર્સ સિનેપ્સ અને મેટાબોલોમના સભ્યો છે. જો કે, SOD1 અને myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate (MARCKS), જે અનુક્રમે માયલિન અને ગ્લિયલ રોગપ્રતિકારક જૂથના સભ્યો છે, તે પણ આ જૂથના છે (આકૃતિ 6, D અને E). વેસ્ક્યુલર પેનલે બે માર્કર્સનું પણ યોગદાન આપ્યું હતું જે AD-જેવા AsymAD જૂથમાં નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડી દેવામાં આવ્યા હતા, જેમાં AE બંધનકર્તા પ્રોટીન 1 (AEBP1) અને પરિવારના સભ્ય C9નો પૂરક સમાવેશ થાય છે. ELISA AB1-42 (P = 0.38) અને p-tau (P = 0.28) માં નિયંત્રણ અને AD-જેવા AsymAD પેટાજૂથો વચ્ચે કોઈ નોંધપાત્ર તફાવત નહોતો, પરંતુ કુલ ટાઉ સ્તર (P = 0.0031) માં ખરેખર નોંધપાત્ર તફાવત હતો. ) (ફિગ. S7). ત્યાં ઘણા પેનલ માર્કર છે જે સૂચવે છે કે બે AsymAD પેટાજૂથો વચ્ચેના ફેરફારો કુલ ટાઉ સ્તરો કરતાં વધુ નોંધપાત્ર છે (ઉદાહરણ તરીકે, YWHAZ, SOD1, અને MDH1) (આકૃતિ 6E). એકંદરે, આ પરિણામો સૂચવે છે કે અમારી માન્ય પેનલમાં બાયોમાર્કર્સ હોઈ શકે છે જે એસિમ્પટમેટિક રોગ ધરાવતા દર્દીઓના પેટા પ્રકાર અને સંભવિત જોખમ સ્તરીકરણ કરી શકે છે.
એડી પાછળના વિવિધ પેથોફિઝિયોલોજીને વધુ સારી રીતે માપવા અને લક્ષ્ય બનાવવા માટે સિસ્ટમ-આધારિત બાયોમાર્કર ટૂલ્સની તાત્કાલિક જરૂરિયાત છે. આ સાધનો માત્ર અમારા AD ડાયગ્નોસ્ટિક ફ્રેમવર્કને બદલશે નહીં, પરંતુ અસરકારક, દર્દી-વિશિષ્ટ સારવાર વ્યૂહરચનાઓ (1, 2) ને અપનાવવામાં પણ પ્રોત્સાહન આપશે તેવી અપેક્ષા છે. આ માટે, અમે વેબ-આધારિત CSF બાયોમાર્કર્સ કે જે મગજ-આધારિત પેથોફિઝિયોલોજીની વ્યાપક શ્રેણીને પ્રતિબિંબિત કરે છે તે ઓળખવા માટે AD મગજ અને CSF માટે એક નિષ્પક્ષ વ્યાપક પ્રોટીઓમિક્સ અભિગમ લાગુ કર્યો. અમારા વિશ્લેષણે પાંચ CSF બાયોમાર્કર પેનલ્સ ઉત્પન્ન કર્યા, જે (i) ચેતોપાગમ, રક્તવાહિનીઓ, માયલિન, રોગપ્રતિકારક અને મેટાબોલિક ડિસફંક્શનને પ્રતિબિંબિત કરે છે; (ii) વિવિધ MS પ્લેટફોર્મ પર મજબૂત પ્રજનનક્ષમતા દર્શાવો; (iii) એડીના પ્રારંભિક અને અંતના તબક્કામાં પ્રગતિશીલ રોગ-વિશિષ્ટ ફેરફારો બતાવો. એકંદરે, આ તારણો એડી સંશોધન અને ક્લિનિકલ એપ્લિકેશન્સ માટે વૈવિધ્યસભર, વિશ્વસનીય, વેબ-ઓરિએન્ટેડ બાયોમાર્કર ટૂલ્સના વિકાસ તરફ એક આશાસ્પદ પગલું રજૂ કરે છે.
અમારા પરિણામો એડી બ્રેઈન નેટવર્ક પ્રોટીઓમના અત્યંત સંરક્ષિત સંગઠનને દર્શાવે છે અને સિસ્ટમ-આધારિત બાયોમાર્કર વિકાસ માટે એન્કર તરીકે તેના ઉપયોગને સમર્થન આપે છે. અમારું વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે AD અને AsymAD મગજ ધરાવતા બે સ્વતંત્ર TMT-MS ડેટાસેટ્સ મજબૂત મોડ્યુલારિટી ધરાવે છે. આ તારણો અમારા પાછલા કાર્યને વિસ્તૃત કરે છે, જે આગળના, પેરિએટલ અને ટેમ્પોરલ કોર્ટેક્સ (17) માં બહુવિધ સ્વતંત્ર સમૂહોમાંથી 2,000 થી વધુ મગજની પેશીઓના શક્તિશાળી મોડ્યુલોનું સંરક્ષણ દર્શાવે છે. આ સર્વસંમતિ નેટવર્ક વર્તમાન સંશોધનમાં જોવા મળેલા વિવિધ રોગ-સંબંધિત ફેરફારોને પ્રતિબિંબિત કરે છે, જેમાં ગ્લિયાલ-સમૃદ્ધ બળતરા મોડ્યુલોનો વધારો અને ન્યુરોન-સમૃદ્ધ મોડ્યુલોમાં ઘટાડો સામેલ છે. વર્તમાન સંશોધનની જેમ, આ મોટા પાયે નેટવર્ક પણ AsymAD માં નોંધપાત્ર મોડ્યુલર ફેરફારો દર્શાવે છે, જે વિવિધ પ્રીક્લિનિકલ પેથોફિઝિયોલોજી (17) દર્શાવે છે.
જો કે, આ અત્યંત રૂઢિચુસ્ત પ્રણાલી-આધારિત માળખામાં, ખાસ કરીને AD ના પ્રારંભિક તબક્કામાં વ્યક્તિઓમાં વધુ સુક્ષ્મ જૈવિક વિજાતીયતા છે. અમારી બાયોમાર્કર પેનલ AsymAD માં બે પેટાજૂથોનું નિરૂપણ કરવામાં સક્ષમ છે, જે બહુવિધ CSF માર્કર્સની નોંધપાત્ર વિભેદક અભિવ્યક્તિ દર્શાવે છે. અમારું જૂથ આ બે પેટાજૂથો વચ્ચેના જૈવિક તફાવતોને પ્રકાશિત કરવામાં સક્ષમ હતું, જે કોર એડી બાયોમાર્કર્સના સ્તરે સ્પષ્ટ ન હતા. નિયંત્રણ જૂથની તુલનામાં, આ AsymAD વ્યક્તિઓના Aβ1-42/કુલ ટાઉ રેશિયો અસામાન્ય રીતે ઓછા હતા. જો કે, બે AsymAD પેટાજૂથો વચ્ચે માત્ર કુલ ટાઉ સ્તર નોંધપાત્ર રીતે અલગ હતા, જ્યારે Aβ1-42 અને p-ટાઉ સ્તરો પ્રમાણમાં તુલનાત્મક રહ્યા હતા. ઉચ્ચ CSF ટાઉ એ Aβ1-42 સ્તરો (7) કરતાં જ્ઞાનાત્મક લક્ષણોનું વધુ સારું આગાહી કરનાર હોવાનું જણાય છે, અમને શંકા છે કે બે AsymAD જૂથોમાં રોગની પ્રગતિના વિવિધ જોખમો હોઈ શકે છે. અમારા AsymAD ના મર્યાદિત નમૂનાના કદ અને રેખાંશ માહિતીના અભાવને જોતાં, વિશ્વાસપૂર્વક આ તારણો કાઢવા માટે વધુ સંશોધનની જરૂર છે. જો કે, આ પરિણામો સૂચવે છે કે સિસ્ટમ-આધારિત CSF પેનલ રોગના એસિમ્પટમેટિક તબક્કા દરમિયાન વ્યક્તિઓને અસરકારક રીતે સ્તરીકરણ કરવાની અમારી ક્ષમતાને વધારી શકે છે.
એકંદરે, અમારા તારણો AD ના પેથોજેનેસિસમાં બહુવિધ જૈવિક કાર્યોની ભૂમિકાને સમર્થન આપે છે. જો કે, અવ્યવસ્થિત ઊર્જા ચયાપચય એ અમારી પાંચેય માન્ય લેબલીંગ પેનલની મુખ્ય થીમ બની હતી. મેટાબોલિક પ્રોટીન, જેમ કે હાયપોક્સેન્થિન-ગુઆનાઇન ફોસ્ફોરીબોસિલટ્રાન્સફેરેઝ 1 (HPRT1) અને લેક્ટેટ ડીહાઇડ્રોજેનેઝ A (LDHA), સૌથી મજબૂત રીતે માન્ય સિનેપ્ટિક બાયોમાર્કર્સ છે, જે દર્શાવે છે કે AD CSF માં વધારો અત્યંત પ્રજનનક્ષમ સેક્સ છે. અમારી રક્તવાહિનીઓ અને ગ્લિયલ પેનલ્સમાં ઓક્સિડેટીવ પદાર્થોના ચયાપચયમાં સામેલ ઘણા માર્કર પણ હોય છે. આ તારણો સમગ્ર મગજમાં ચયાપચયની પ્રક્રિયાઓ ભજવે છે તે મુખ્ય ભૂમિકા સાથે સુસંગત છે, માત્ર ચેતાકોષોની ઉચ્ચ ઊર્જા માંગને પહોંચી વળવા માટે જ નહીં, પણ એસ્ટ્રોસાયટ્સ અને અન્ય ગ્લિયલ કોશિકાઓની ઉચ્ચ ઊર્જા માંગને પણ પૂરી કરવા માટે (17, 48). અમારા પરિણામો વધતા પુરાવાને સમર્થન આપે છે કે રેડોક્સ સંભવિતમાં ફેરફાર અને ઉર્જા માર્ગોમાં વિક્ષેપ એ AD ના પેથોજેનેસિસમાં સામેલ કેટલીક મુખ્ય પ્રક્રિયાઓ વચ્ચેની મુખ્ય કડી હોઈ શકે છે, જેમાં મિટોકોન્ડ્રીયલ ડિસઓર્ડર, ગ્લિયલ-મધ્યસ્થી બળતરા અને વેસ્ક્યુલર નુકસાન (49) નો સમાવેશ થાય છે. આ ઉપરાંત, મેટાબોલિક સેરેબ્રોસ્પાઇનલ ફ્લુઇડ બાયોમાર્કર્સમાં આપણા નિયંત્રણ અને AD-જેવા AsymAD પેટાજૂથો વચ્ચે મોટી સંખ્યામાં વિભિન્ન રીતે સમૃદ્ધ પ્રોટીન હોય છે, જે સૂચવે છે કે આ ઊર્જા અને રેડોક્સ માર્ગોના વિક્ષેપ રોગના પૂર્વનિર્ધારણ તબક્કામાં ગંભીર હોઈ શકે છે.
વિવિધ મગજ અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ ફ્લુઇડ પેનલ વલણો અમે જોયા છે તેમાં પણ રસપ્રદ જૈવિક અસરો છે. ચેતાકોષોથી સમૃદ્ધ સિનેપ્સ અને મેટાબોલોમ્સ એડી મગજમાં ઘટાડો સ્તર અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીમાં વિપુલતા દર્શાવે છે. આપેલ છે કે ચેતાકોષો તેમના અસંખ્ય વિશિષ્ટ સંકેતો (50) માટે ઊર્જા પ્રદાન કરવા માટે ચેતોપાગમ પર ઊર્જા ઉત્પન્ન કરતા મિટોકોન્ડ્રિયામાં સમૃદ્ધ છે, આ બે ચેતાકોષ જૂથોની અભિવ્યક્તિ પ્રોફાઇલ્સની સમાનતા અપેક્ષિત છે. ચેતાકોષોની ખોટ અને ક્ષતિગ્રસ્ત કોશિકાઓનું બહાર કાઢવું ​​એ પછીના રોગમાં આ મગજ અને CSF પેનલ વલણોને સમજાવી શકે છે, પરંતુ તે અમે અવલોકન કરીએ છીએ તે પ્રારંભિક પેનલ ફેરફારોને સમજાવી શકતા નથી (13). પ્રારંભિક એસિમ્પટમેટિક રોગમાં આ તારણો માટે એક સંભવિત સમજૂતી એ અસામાન્ય સિનેપ્ટિક કાપણી છે. માઉસ મોડેલોમાં નવા પુરાવા સૂચવે છે કે માઇક્રોગ્લિયા-મધ્યસ્થી સિનેપ્ટિક ફેગોસિટોસિસ એડી માં અસામાન્ય રીતે સક્રિય થઈ શકે છે અને મગજમાં પ્રારંભિક ચેતોપાગમ નુકશાન તરફ દોરી શકે છે (51). આ કાઢી નાખવામાં આવેલ સિનેપ્ટિક સામગ્રી CSF માં એકઠા થઈ શકે છે, તેથી જ અમે ન્યુરોન પેનલમાં CSF માં થયેલા વધારાનું અવલોકન કરીએ છીએ. રોગપ્રતિકારક-મધ્યસ્થી સિનેપ્ટિક કાપણી પણ આંશિક રીતે રોગની પ્રક્રિયા દરમિયાન મગજ અને સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીમાં જોવા મળતા ગ્લિયલ પ્રોટીનમાં વધારો સમજાવી શકે છે. સિનેપ્ટિક કાપણી ઉપરાંત, એક્ઝોસાયટીક પાથવેમાં એકંદર અસાધારણતા મગજ અને ન્યુરોનલ માર્કર્સના CSF અભિવ્યક્તિઓ તરફ દોરી શકે છે. સંખ્યાબંધ અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે એડી મગજના પેથોજેનેસિસમાં એક્સોસોમ્સની સામગ્રી બદલાઈ ગઈ છે (52). એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર પાથવે Aβ (53, 54) ના પ્રસારમાં પણ સામેલ છે. એ નોંધવું યોગ્ય છે કે એક્સોસોમલ સ્ત્રાવને દબાવવાથી એડી ટ્રાન્સજેનિક માઉસ મોડલ્સ (55) માં એડી જેવી પેથોલોજી ઘટાડી શકે છે.
તે જ સમયે, વેસ્ક્યુલર પેનલમાં પ્રોટીન એ AD મગજમાં મધ્યમ વધારો દર્શાવે છે, પરંતુ CSF માં નોંધપાત્ર ઘટાડો થયો છે. બ્લડ-બ્રેઇન બેરિયર (BBB) ​​ડિસફંક્શન આંશિક રીતે આ તારણોને સમજાવી શકે છે. ઘણા સ્વતંત્ર પોસ્ટમોર્ટમ માનવ અભ્યાસોએ એડી (56, 57) માં BBB ભંગાણ દર્શાવ્યું છે. આ અભ્યાસોએ એન્ડોથેલિયલ કોશિકાઓના આ ચુસ્તપણે સીલબંધ સ્તરની આસપાસની વિવિધ અસામાન્ય પ્રવૃત્તિઓની પુષ્ટિ કરી છે, જેમાં મગજની કેશિલરી લિકેજ અને રક્ત-જન્મિત પ્રોટીન (57) ના પેરીવાસ્ક્યુલર સંચયનો સમાવેશ થાય છે. આ મગજમાં એલિવેટેડ વેસ્ક્યુલર પ્રોટીન માટે એક સરળ સમજૂતી પ્રદાન કરી શકે છે, પરંતુ તે સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીમાં આ સમાન પ્રોટીનની અવક્ષયને સંપૂર્ણપણે સમજાવી શકતું નથી. એક શક્યતા એ છે કે સેન્ટ્રલ નર્વસ સિસ્ટમ વધેલી બળતરા અને ઓક્સિડેટીવ તણાવની સમસ્યાને ઉકેલવા માટે સક્રિયપણે આ પરમાણુઓને અલગ કરી રહી છે. આ પેનલમાંના કેટલાક સૌથી ગંભીર CSF પ્રોટીનમાં ઘટાડો, ખાસ કરીને જેઓ લિપોપ્રોટીન નિયમનમાં સામેલ છે, તે બળતરાના હાનિકારક સ્તરના નિષેધ અને પ્રતિક્રિયાશીલ ઓક્સિજન પ્રજાતિઓની ન્યુરોપ્રોટેક્ટીવ પ્રક્રિયા સાથે સંબંધિત છે. આ પેરોક્સોનાઝ 1 (PON1) માટે સાચું છે, એક લિપોપ્રોટીન બંધનકર્તા એન્ઝાઇમ જે પરિભ્રમણમાં ઓક્સિડેટીવ તણાવ સ્તર ઘટાડવા માટે જવાબદાર છે (58, 59). આલ્ફા-1-માઇક્રોગ્લોબ્યુલિન/બિકુનિન પ્રિકર્સર (એએમબીપી) એ વેસ્ક્યુલર જૂથનું બીજું નોંધપાત્ર રીતે ડાઉન-રેગ્યુલેટેડ માર્કર છે. તે લિપિડ ટ્રાન્સપોર્ટર બિકુનિનનો પુરોગામી છે, જે બળતરાના દમન અને ન્યુરોલોજીકલ પ્રોટેક્શનમાં પણ સામેલ છે (60, 61).
વિવિધ રસપ્રદ પૂર્વધારણાઓ હોવા છતાં, બાયોકેમિકલ રોગ મિકેનિઝમ્સને સીધી રીતે શોધવામાં અસમર્થતા એ શોધ-સંચાલિત પ્રોટીઓમિક્સ વિશ્લેષણની જાણીતી મર્યાદા છે. તેથી, આ બાયોમાર્કર પેનલ્સ પાછળની પદ્ધતિને વિશ્વાસપૂર્વક વ્યાખ્યાયિત કરવા માટે વધુ સંશોધન જરૂરી છે. MS-આધારિત ક્લિનિકલ વિશ્લેષણના વિકાસ તરફ આગળ વધવા માટે, ભાવિ દિશા માટે મોટા પાયે બાયોમાર્કર ચકાસણી માટે લક્ષિત માત્રાત્મક પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરવાની પણ જરૂર છે, જેમ કે પસંદગીયુક્ત અથવા સમાંતર પ્રતિક્રિયા મોનિટરિંગ (62). અમે તાજેતરમાં અહીં વર્ણવેલ CSF પ્રોટીન ફેરફારોને માન્ય કરવા માટે સમાંતર પ્રતિક્રિયા મોનિટરિંગ (63) નો ઉપયોગ કર્યો છે. YWHAZ, ALDOA, અને SMOC1 સહિત, કેટલાક અગ્રતા પેનલ લક્ષ્યોને નોંધપાત્ર ચોકસાઈ સાથે પરિમાણિત કરવામાં આવે છે, જે અનુક્રમે આપણા ચેતોપાગમ, ચયાપચય, અને બળતરા પેનલને નકશા કરે છે (63). ઇન્ડિપેન્ડન્ટ ડેટા એક્વિઝિશન (DIA) અને અન્ય MS-આધારિત વ્યૂહરચનાઓ પણ લક્ષ્યની ચકાસણી માટે ઉપયોગી થઈ શકે છે. બડ એટ અલ. (64) તાજેતરમાં એવું દર્શાવવામાં આવ્યું હતું કે અમારા CSF શોધ ડેટા સેટમાં ઓળખાયેલા AD બાયોમાર્કર્સ અને સ્વતંત્ર DIA-MS ડેટા સેટ વચ્ચે નોંધપાત્ર ઓવરલેપ છે, જેમાં ત્રણ અલગ-અલગ યુરોપિયન સમૂહોમાંથી લગભગ 200 CSF નમૂનાઓનો સમાવેશ થાય છે. આ તાજેતરના અભ્યાસો વિશ્વસનીય MS-આધારિત શોધમાં પરિવર્તિત થવાની અમારી પેનલની સંભવિતતાને સમર્થન આપે છે. કી AD બાયોમાર્કર્સના વધુ વિકાસ માટે પરંપરાગત એન્ટિબોડી અને એપ્ટેમર-આધારિત શોધ પણ મહત્વપૂર્ણ છે. CSF ની ઓછી વિપુલતાને લીધે, ઉચ્ચ-થ્રુપુટ MS પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરીને આ બાયોમાર્કર્સને શોધવાનું વધુ મુશ્કેલ છે. NEFL અને NRGN એ નીચા-વિપુલતા ધરાવતા CSF બાયોમાર્કર્સના આવા બે ઉદાહરણો છે, જે અમારા વ્યાપક વિશ્લેષણમાં પેનલ સાથે મેપ કરવામાં આવ્યા છે, પરંતુ અમારી સિંગલ MS વ્યૂહરચનાનો ઉપયોગ કરીને વિશ્વસનીય રીતે શોધી શકાતા નથી. બહુવિધ એન્ટિબોડીઝ પર આધારિત લક્ષ્યીકરણ વ્યૂહરચનાઓ, જેમ કે PEA, આ માર્કર્સના ક્લિનિકલ પરિવર્તનને પ્રોત્સાહન આપી શકે છે.
એકંદરે, આ અભ્યાસ વિવિધ સિસ્ટમો પર આધારિત CSF AD બાયોમાર્કર્સની ઓળખ અને ચકાસણી માટે અનન્ય પ્રોટીઓમિક્સ અભિગમ પૂરો પાડે છે. વધારાના AD સમૂહો અને MS પ્લેટફોર્મ પર આ માર્કર પેનલ્સને ઑપ્ટિમાઇઝ કરવું એ AD જોખમ સ્તરીકરણ અને સારવારને આગળ વધારવા માટે આશાસ્પદ સાબિત થઈ શકે છે. સમયાંતરે આ પેનલોના રેખાંશ સ્તરનું મૂલ્યાંકન કરતા અભ્યાસો એ નિર્ધારિત કરવા માટે પણ મહત્વપૂર્ણ છે કે કયા માર્કર્સનું સંયોજન પ્રારંભિક રોગના જોખમ અને રોગની તીવ્રતામાં ફેરફારને શ્રેષ્ઠ રીતે સ્તરીકરણ કરે છે.
CSF દ્વારા નકલ કરાયેલા 3 નમૂનાઓ સિવાય, આ અભ્યાસમાં ઉપયોગમાં લેવાતા તમામ CSF નમૂનાઓ Emory ADRC અથવા નજીકથી સંબંધિત સંશોધન સંસ્થાઓના આશ્રય હેઠળ એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા. આ પ્રોટીઓમિક્સ અભ્યાસોમાં એમોરી CSF નમૂનાઓના કુલ ચાર સેટનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. CSF સમૂહમાં 20 તંદુરસ્ત નિયંત્રણો અને 20 એડી દર્દીઓના નમૂનાઓ હોવાનું જણાયું હતું. CSF નકલ 1 માં 32 તંદુરસ્ત નિયંત્રણો, 31 AsymAD વ્યક્તિઓ અને 33 AD વ્યક્તિઓના નમૂનાઓનો સમાવેશ થાય છે. CSF નકલ 2 માં 147 નિયંત્રણો અને 150 AD નમૂનાઓ છે. મલ્ટિ-ડિસીઝ CSF પ્રતિકૃતિ 4 સમૂહમાં 18 નિયંત્રણો, 17 એડી, 19 એએલએસ, 13 પીડી અને 11 એફટીડી નમૂનાઓનો સમાવેશ થાય છે. Emory યુનિવર્સિટી સંસ્થાકીય સમીક્ષા બોર્ડ દ્વારા મંજૂર કરાયેલ કરાર અનુસાર, બધા Emory અભ્યાસ સહભાગીઓએ જાણકાર સંમતિ મેળવી હતી. 2014ની નેશનલ ઇન્સ્ટિટ્યૂટ ઓફ એજીંગ બેસ્ટ પ્રેક્ટિસ ગાઇડલાઇન્સ ફોર અલ્ઝાઇમર સેન્ટર્સ (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html) અનુસાર, કટિ પંચર દ્વારા સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી એકત્ર અને સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યું હતું. નિયંત્રણ અને AsymAD અને AD દર્દીઓને Emory Cognitive Neurology Clinic અથવા Goizueta ADRC ખાતે પ્રમાણિત જ્ઞાનાત્મક મૂલ્યાંકન પ્રાપ્ત થયું. INNO-BIA AlzBio3 Luminex દ્વારા તેમના સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહીના નમૂનાઓનું પરીક્ષણ ELISA Aβ1-42, કુલ ટાઉ અને પી-ટાઉ વિશ્લેષણ (65) માટે કરવામાં આવ્યું હતું. ELISA મૂલ્યોનો ઉપયોગ સ્થાપિત AD બાયોમાર્કર કટ-ઓફ માપદંડ (66, 67) પર આધારિત વિષયોના ડાયગ્નોસ્ટિક વર્ગીકરણને સમર્થન આપવા માટે થાય છે. અન્ય CSF નિદાન (FTD, ALS અને PD) માટે મૂળભૂત વસ્તી વિષયક અને ડાયગ્નોસ્ટિક ડેટા પણ Emory ADRC અથવા સંલગ્ન સંશોધન સંસ્થાઓ પાસેથી મેળવવામાં આવે છે. આ Emory CSF કેસો માટે સારાંશ કેસ મેટાડેટા કોષ્ટક S1A માં મળી શકે છે. સ્વિસ CSF પ્રતિકૃતિ 3 સમૂહની લાક્ષણિકતાઓ અગાઉ પ્રકાશિત કરવામાં આવી છે (45).
CSF ને નમૂના મળ્યા. CSF ડેટા સેટની અમારી શોધની ઊંડાઈ વધારવા માટે, ટ્રિપ્સિનાઇઝેશન પહેલાં ઉચ્ચ-વિપુલ પ્રોટીનનો રોગપ્રતિકારક વપરાશ કરવામાં આવ્યો હતો. ટૂંકમાં, 40 વ્યક્તિગત CSF નમૂનાઓમાંથી 130 μl CSF અને એક સમાન વોલ્યુમ (130 μl) હાઇ સિલેક્ટ ટોપ14 એબ્યુન્ડન્સ પ્રોટીન ડિપ્લેશન રેઝિન (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક, A36372) સ્પિન કોલમમાં (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક, A8988) રૂમમાં મૂકવામાં આવ્યા હતા. તાપમાન ઇન્ક્યુબેટ). 15 મિનિટ સુધી સ્પિનિંગ કર્યા પછી, સેમ્પલને 1000 ગ્રામ પર 2 મિનિટ માટે સેન્ટ્રીફ્યુજ કરો. 3K અલ્ટ્રાસેન્ટ્રીફ્યુગલ ફિલ્ટર ઉપકરણ (મિલિપોર, UFC500396) નો ઉપયોગ 30 મિનિટ માટે 14,000 ગ્રામ પર સેન્ટ્રીફ્યુગ કરીને પ્રવાહીના નમૂનાને કેન્દ્રિત કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. ફોસ્ફેટ બફર કરેલ ખારા સાથે તમામ નમૂનાના જથ્થાને 75 μl સુધી પાતળું કરો. પ્રોટીનની સાંદ્રતાનું મૂલ્યાંકન ઉત્પાદકના પ્રોટોકોલ (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) અનુસાર બાયસિન્કોનિનિક એસિડ (બીસીએ) પદ્ધતિ દ્વારા કરવામાં આવ્યું હતું. તમામ 40 નમૂનાઓમાંથી ઇમ્યુનોડિપ્લેટેડ CSF (60 μl) lysyl endopeptidase (LysC) અને ટ્રિપ્સિન સાથે પાચન કરવામાં આવ્યું હતું. ટૂંકમાં, નમૂનાને 1.2 μl 0.5 M tris-2(-carboxyethyl)-phosphine અને 3 μl 0.8 M ક્લોરોએસેટામાઇડ સાથે 90 °C પર 10 મિનિટ માટે ઘટાડી અને અલ્કાયલેટ કરવામાં આવ્યું હતું, અને પછી 15 મિનિટ માટે પાણીના સ્નાનમાં સોનિક કરવામાં આવ્યું હતું. નમૂનાને 193 μl 8 M યુરિયા બફર [8 M યુરિયા અને 100 mM NaHPO4 (pH 8.5)] સાથે 6 M યુરિયાની અંતિમ સાંદ્રતા માટે પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું. LysC (4.5 μg; Wako) નો ઉપયોગ ઓરડાના તાપમાને રાતોરાત પાચન માટે થાય છે. પછી નમૂનાને 50 એમએમ એમોનિયમ બાયકાર્બોનેટ (ABC) (68) સાથે 1 M યુરિયામાં ભેળવવામાં આવ્યું હતું. ટ્રિપ્સિન (પ્રોમેગા) ની સમાન માત્રામાં (4.5 μg) ઉમેરો અને પછી નમૂનાને 12 કલાક માટે ઉકાળો. 1% ફોર્મિક એસિડ (FA) અને 0.1% ટ્રાઇફ્લુરોએસેટિક એસિડ (TFA) (66) ની અંતિમ સાંદ્રતા માટે ડાયજેસ્ટેડ પેપ્ટાઇડ સોલ્યુશનને એસિડિફાઇ કરો, અને પછી ઉપર વર્ણવ્યા પ્રમાણે 50 મિલિગ્રામ Sep-Pak C18 કોલમ (પાણી) વડે ડિસોલ્ટ કરો (25) . ત્યારબાદ પેપ્ટાઈડ 50% એસેટોનાઈટ્રાઈલ (ACN) ના 1 મિલીલીટરમાં બહાર કાઢવામાં આવ્યું હતું. સમગ્ર બૅચેસ (25)માં પ્રોટીનના પ્રમાણને પ્રમાણિત કરવા માટે, તમામ 40 CSF નમૂનાઓમાંથી 100 μl અલિકોટ્સ મિશ્રિત નમૂના બનાવવા માટે જોડવામાં આવ્યા હતા, જે પછી પાંચ વૈશ્વિક આંતરિક ધોરણ (GIS) (48) નમૂનાઓમાં વિભાજિત કરવામાં આવ્યા હતા. બધા વ્યક્તિગત નમૂનાઓ અને સંયુક્ત ધોરણો હાઇ-સ્પીડ વેક્યુમ (લેબકોન્કો) દ્વારા સૂકવવામાં આવે છે.
CSF નમૂનાની નકલ કરે છે. ડેયોન અને સહકર્મીઓએ અગાઉ CSF નકલ 3 નમૂનાઓ (45, 46) ની રોગપ્રતિકારક અવક્ષય અને પાચનનું વર્ણન કર્યું છે. બાકીના પ્રતિકૃતિ નમૂનાઓ વ્યક્તિગત રીતે ઇમ્યુનોડિપ્લેટેડ ન હતા. અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ આ દૂર ન કરેલા નમૂનાઓને ટ્રિપ્સિનમાં ડાયજેસ્ટ કરો (17). દરેક પુનરાવર્તિત વિશ્લેષણ માટે, દરેક નમૂનામાંથી એલ્યુટેડ પેપ્ટાઈડના 120 μl એલિકોટ્સને એકસાથે એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા અને TMT- લેબલવાળા વૈશ્વિક આંતરિક ધોરણ (48) તરીકે ઉપયોગમાં લેવા માટે સમાન વોલ્યુમ એલિક્વોટ્સમાં વિભાજિત કરવામાં આવ્યા હતા. બધા વ્યક્તિગત નમૂનાઓ અને સંયુક્ત ધોરણો હાઇ-સ્પીડ વેક્યુમ (લેબકોન્કો) દ્વારા સૂકવવામાં આવે છે. ઓછી વિપુલતા ધરાવતા CSF પ્રોટીનના સંકેતને વધારવા માટે, દરેક નમૂનામાંથી 125 μl નું સંયોજન કરીને, દરેક નકલ વિશ્લેષણ માટે એક "ઉન્નત" નમૂનો તૈયાર કરવામાં આવ્યો હતો [એટલે ​​કે, એક જૈવિક નમૂના જે સંશોધન નમૂનાની નકલ કરે છે, પરંતુ ઉપલબ્ધ જથ્થો છે. ઘણું મોટું (37, 69)] મિશ્ર CSF નમૂના (17) માં ભળી જાય છે. મિશ્રિત નમૂનાને પછી 12 મિલી હાઇ સિલેક્ટ ટોપ14 એબ્યુન્ડન્સ પ્રોટીન રિમૂવલ રેઝિન (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક, A36372) નો ઉપયોગ કરીને રોગપ્રતિકારક શક્તિ દૂર કરવામાં આવી હતી, જે ઉપર વર્ણવ્યા પ્રમાણે પાચન કરવામાં આવ્યું હતું અને ત્યારબાદના બહુવિધ TMT લેબલિંગમાં સમાવવામાં આવ્યું હતું.